(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210464723.1 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 苏州天隆生物科技有限公司 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区 金鸡湖大道99 号纳米城西北区7栋501 室 (72)发明人 李政　王小舟　张扬　王雨　 (74)专利代理 机构 成都九鼎天元知识产权代理 有限公司 51214 专利代理师 胡东东 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 25/20(2019.01)G16B 30/00(2019.01) (54)发明名称 检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的 试剂盒及分析方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测人运动神经元存活 基因SMN1拷贝数的试剂盒及分析方法， 本发明通 过控制PCR反应中核心原料引物的使用浓度建立 惰性多重PCR反应体系， 在极限引物使用浓度的 前提下， PCR扩增结束后引物被完全消耗完成， 结 合内参基因归一化熔解曲线分析， 实现7、 8号外 显子SMN1基因拷贝数的精准定量； 同时， 通过 ARMS‑PCR结合荧光染料熔解曲线方法， 对SMN1基 因存在的不同致病性突变体进行检测， 分析ΔTm 值大小即可实现对应的基因突变位点。 本检测方 法操作简单、 检测准确性高、 耗时短且检测成本 低， 适用与大规模人群SMA致病基因SMN1的携带 者检测， 在检测基因拷贝数变异的同时， 能同步 实现因基因突变导致SMA病患， 检测覆盖面显著 提高， 有效避免漏检 。 权利要求书2页 说明书16页 附图5页 CN 114736958 A 2022.07.12 CN 114736958 A 1.一种检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的试剂盒， 包括SMN1 ‑7主反应液和 SMN1‑8主反应液， 其特征在于， 所述SMN1 ‑7主反应液包含浓度范围为10nM～75nM的SMN1 ‑ 7FP引物， 以及浓度范围为10nM～75nM的SMN1 ‑7RP引物， 所述SMN1 ‑8主反应液包含浓度范围 为10nM～75nM的SMN1 ‑8FP引物， 以及浓度范围为10nM～75nM的SMN1 ‑8RP引物。 2.如权利要求1所述的检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的试剂盒， 其特征在于， 所述SMN1 ‑7主反应液中还包含浓度范围为10nM～75nM的CFTR ‑FP引物， 以及浓度范围为 10nM～75nM的CFTR ‑RP引物； 所述SMN1 ‑8主反应液中还包含浓度范围为10nM～75nM的 TPGS2‑FP引物， 以及浓度范围为10nM～75nM的TPGS2 ‑RP引物。 3.如权利要求1所述的检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的试剂盒， 其特征在于， 在所述SMN1 ‑7主反应液中， SMN1 ‑7FP引物浓度 范围为20nM～30nM， SMN1 ‑7RP引物浓度 范围 为20nM～30nM； 在所述SMN1 ‑8主反应液中， SMN1 ‑8FP引物浓度范围为2 0nM～30nM， SMN1 ‑7RP 引物浓度范围为20nM～3 0nM。 4.如权利要求3所述的检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的试剂盒， 其特征在于， 所述SMN1 ‑7主反应液中还包含浓度范围为20nM～30nM的CFTR ‑FP引物， 以及浓度范围为 20nM～30nM的CFTR ‑RP引物； 所述SMN1 ‑8主反应液中还包含浓度范围为20nM～30nM的 TPGS2‑FP引物， 以及浓度范围为20nM～3 0nM的TPGS2 ‑RP引物。 5.如权利要求1所述的检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的试剂盒， 其特征在于， 所述SMN1 ‑7FP引物序列为SEQ  ID NO： 1， 所述SMN1 ‑7RP引物序列为SEQ  ID NO： 2， 所述SMN1 ‑ 8FP引物序列为SEQ  ID NO： 5， 所述SMN1 ‑8RP引物序列为SEQ  ID NO： 6。 6.如权利要求2所述的检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的试剂盒， 其特征在于， 所述CFTR ‑FP引物序列为SEQ  ID NO： 3， 所述CFTR ‑RP引物序列 为SEQ ID NO： 4， 所述TP GS2‑ FP引物序列为SEQ  ID NO： 7， 所述TPGS2 ‑RP引物序列为SEQ  ID NO： 8。 7.如权利要求1 ‑6任一所述的检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的试剂盒， 其特 征在于， 所述SMN1 ‑7主反应液和/或所述SMN1 ‑8主反应液还包含35～50mM  Tris、 2.5～ 3.0mM MgCl2、 300～500mg/L BSA、 100～200 μMdNTPs、 20～5 0×Syto 9染料以及纯化水。 8.一种检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数以及基因碱基突变的试剂盒， 其特征在 于， 包含上述权利要求 1‑7任一所述的试剂盒， 所述试剂盒中还包含SMN 1‑SNP突变位点主反 应液， 所述 突变位点主反应液中包 含浓度范围为5 0～100nM的突变位 点引物对。 9.如权利要求8所述的检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数以及基因碱基突变的试 剂盒， 其特征在于， 所述突变位点引物包含c.863G＞T引物对、 c.400G＞A引物对、 c.689C＞T 引物对、 c.683T＞A引物对和c.2 2dupA引物对。 10.一种对人运动神经元存活基因SMN1拷贝数进行定量分析的方法， 其特征在于， 在权 利要求1‑9任一所述的试剂盒 中加入待分析溶液， 扩增所述待分析溶液中的核酸片段， 以获 得更多目标核酸片段和参考核酸片段； 熔解经过预设循环数 的扩增后的结果， 以获得未处 理的荧光与温度关系， 去除荧光与温度中的背景噪音， 获得每一靶核酸和参考核酸的熔解 峰， 归一化所述参考核酸的熔解峰， 获取每一靶核酸相对所述参考核酸的熔解峰的峰值高 度差异， 利用所述差异化高度区分不同所述靶核酸序列。 11.一种竞争性扩增相关联的分析方法， 其特征在于， 扩增包含于溶液中样品内的 SMN1‑7基因、 SMN1 ‑8基因和参考基因， 其中所述溶液包括： 用于扩增所述SMN1 ‑7基因、 SMN1 ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114736958 A 28基因的引物对， 所述SMN1 ‑7引物对浓度范围为10nM～75nM， 所述SMN1 ‑8引物对浓度范围为 10nM～75nM； 进行预定循环数的扩增， 完成扩增后进行熔解曲线分析， 将所述SMN1 ‑7基因、 SMN1‑8基因扩增 后的熔解曲线与参考基因扩增 后的熔解曲线进行比较， 获得所述SMN 1‑7基 因、 SMN1‑8基因的原 始拷贝数的量 化结果。 12.如权利 要求11所述的竞争性扩增相关联的分析方法， 其特征在于， 所述SMN1 ‑7引物 对浓度范围为20nM～3 0nM， 所述SMN1 ‑8引物对浓度范围为20nM～3 0nM。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114736958 A 3