(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210474916.5 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 河南省疾病预防控制中心 地址 450000 河南省郑州市农业 南路105号 (72)发明人 崔莹　朱焕文　李立　刘春华　 申洪杰　刘教　 (74)专利代理 机构 广州博联知识产权代理有限 公司 44663 专利代理师 梁志标 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/085(2006.01) (54)发明名称 一种用于蜡样芽胞杆菌检测的试剂盒及其 应用 (57)摘要 本发明涉及一种用于蜡样芽胞杆菌检测的 试剂盒及其应用， 该试剂盒包括RPA扩增反应体 系和CRISPR ‑Cas13a蛋白酶检测体系； 其中， RPA 扩增反应体系包括RPA扩增引物对， CRISPR ‑ Cas13a蛋白酶检测体系包括sgRNA、 Cas13a蛋白 和探针。 本发明还提供了对应的检测方法， 通过 该试剂盒在恒温条件下即可实现对蜡样芽胞杆 菌的检测， 具有检测时间短、 操作 简便、 检测条件 温和、 无需昂贵的专业仪器辅助等优点。 该试剂 盒和对应的检测方法具有良好的应用前景， 有潜 力应用于临床检测。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 114807394 A 2022.07.29 CN 114807394 A 1.一种用于蜡样芽胞杆菌检测的试剂组合， 其特征在于， 包括RPA扩增引物对、 sgRNA、 Cas13a蛋白和探针； 所述RPA扩增引物对选自下组中的至少一种： SEQ  ID NO： 1和SEQ  ID NO： 2所示的引物 对， SEQ ID NO： 3和SEQ  ID NO： 4所示的引物对， SEQ  ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6所示的引物对； 所述sgRNA的序列如SEQ  ID NO： 7所示。 2.一种用于蜡样芽胞杆菌检测的试剂盒， 其特征在于， 包括RPA扩增反应体系和 CRISPR‑Cas13a蛋白酶检测体系； 所述RPA扩增反应体系包括RPA扩增引物对， 所述RPA扩增引物对选自下组中的至少一 种： SEQ ID NO： 1和SEQ  ID NO： 2所示的引物对， SEQ  ID NO： 3和SEQ  ID NO： 4所示的引物对， SEQ ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6所示的引物对； 所述CRISPR ‑Cas13a蛋白酶检测体系包括sgRNA、 Cas13a蛋白和探针； 所述sgRNA的序列 如SEQ ID NO： 7所示。 3.如权利 要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RPA扩增反应体系还包括RPA扩增反应 缓冲液和聚合酶。 4.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RPA扩增反应缓冲液包括RPA  Buffer 和Mg(CH3COO)2。 5.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述PRA扩增反应体系中， 所述RPA扩增引 物对的浓度为每种引物10 ‑20 μM。 6.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas13a蛋白酶检测体系还包 括CRISPR‑Cas13a蛋白酶缓冲液， RNA酶抑制剂。 7.如权利要求2所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括阴性对照品和阳性对照 品。 8.如权利要求7所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述阳性对照品为含有蜡样芽胞杆菌检测 目标序列的T载体； 所述阴性对照为超纯 水。 9.一种蜡样芽胞杆菌的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法应用权利要求2 ‑8任一项 所述的试剂盒进行蜡样芽胞 杆菌的检测， 所述检测方法包括以下步骤： (1)提取待测样本的核酸作为待测模板； (2)将所述待测模板加入所述RPA扩增反应 体系中进行扩增， 得到扩增产物； (3)将所述扩增产物加入所述CRISPR ‑Cas13a蛋白酶检测体系， 在等温条件下收集检测 信号。 10.如权利要求9所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增的反应温度为35 ‑45℃； 所述 扩增反应的时间为15 ‑30min； 所述等温条件为3 5‑45℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807394 A 2一种用于蜡样芽胞杆菌检测的试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物检测技术领域， 具体涉及 一种用于蜡样芽胞杆菌检测的试剂盒及 其应用。 背景技术 [0002]蜡样芽胞杆菌(Bacillus  cereus)是一种兼性厌氧的杆状革兰氏阳性细菌， 该菌 属于芽孢杆菌科蜡样芽胞杆菌属， 在土壤、 水、 植物、 饲料以及各种食品中大量存在； 该菌可 以产生内生孢子， 对环境具有很强的适应性， 能够抵抗高温、 紫外线、 电磁辐 射和有害化学 物质等不利条件。 一方面， 有些菌株与很多同属的菌株一样， 如枯草芽孢杆菌、 短短芽孢杆 菌， 能够分泌多种拮抗细菌、 真菌和线虫的活性物质， 是预防植物病害、 杀灭致病菌的有效 活性菌。 另一方面， 蜡样芽胞杆菌属的有 些菌株也一种主要的致病菌， 极易引起食物污染和 食物中毒。 其临床表现主 要是腹泻和呕吐。 [0003]蜡样芽胞杆菌检测方法主要包括了PCR检测、 多重PCR检测(mPCR)、 实时荧光定量 PCR检测(RT ‑qPCR)、 微滴数字PCR检测(ddPCR)、 环介导等温扩增检测(LAMP)、 重组酶聚合酶 扩增检测(RPA)、 酶联免疫吸附测定试验检测(ELISA)、 商业化毒 素检测试剂盒。 都存在一些 缺陷， 比如检测结果精确 性低、 易出现非特异性扩增或交叉反应、 成本高、 易出现假阳性结 果、 引物难设计、 缺乏实时检测微生物的能力、 存在漏检和误检等。 其中， RPA技术对设备要 求低， 特异性良好， 大幅度缩短了检测时间， 可广泛应用于临床和现场检测， 同时也为食品 的质量监测、 疫病检测提供了新的方向。 一方面， 由于引物重组和延伸难以精确控制， 扩增 的批稳健性仍然有限， 使扩增易受环 境变化的影响。 另一方面， 低工作温度可能产生多个非 目标放大， 从而产生意外的噪声信号。 因此， 迫切需要一种操作简单并且高效灵敏的检测技 术。 [0004]张锋教授所在团队对RPA技术的检测能力做了全新诠释， 即等温扩增技术与基因 编辑技术的双剑合璧为核酸等 温扩增检测技术的发展创建了一个新的平台。 研究表明， RPA 能与一种被称为CRISPR(Clustered  regularly  interspaced  short palindromic   repeats)/Cas13a的基因编辑系统相结合， 其检测灵敏度达到了attomolar级(atto molar＝ 10‑3fmol)， 能够识别单个碱基差异。 研究者赋予这种结合一个新的名称： SHERLOCK (Specific  High Sensitivity  Enzymatic  Reporter UnLOCKing)。 [0005]因此， 将RPA技术与CRISPR/Cas13a的基因编辑系统相结合， 能够使检测具有变异 性低、 灵敏度高、 准确率高、 适用场景简单和无需昂贵仪器设备辅助的优点。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种用于蜡样芽胞杆菌检测的试剂盒及 其应用， 通过该试 剂盒在恒温条件下即可实现对蜡样芽胞杆菌的检测， 具有检测时间短、 操作简 便、 检测条件 温和、 无需昂贵的专 业仪器辅助等优点。 该试剂盒和对应的检测方法具有良好的应用前景， 有潜力应用于临床检测。说　明　书 1/6 页 3 CN 114807394 A 3