(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221048280 6.3 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 成都齐碳科技有限公司 地址 610041 四川省成 都市中国 （四川） 自 由贸易试验区成都高新区天府五街 200号7栋A区2 楼 (72)发明人 刘先宇　常馨　肖宓　 (74)专利代理 机构 北京东方亿 思知识产权代理 有限责任公司 1 1258 专利代理师 刘江鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于表征目标多 核苷酸的方法及衔接 体 (57)摘要 本发明提供了用于表征目标多核苷酸的方 法及衔接体。 本发明提供了一种表征目标多核苷 酸的方法， 包括： (a)使目标多核苷酸穿过纳米孔 移动， 其中， 所述目标多核苷酸的测序终端包含 修饰部分， 所述修饰部分使纳米孔堵塞； (b)随着 所述目标多核苷酸相对于所述孔移动， 获取一个 或多个电和/或光测量值。 本发明还提供了用于 表征目标多核苷酸的衔接体， 其中， 所述衔接体 包含修饰部分， 所述修饰部分结合到所述目标多 核苷酸的测序终端， 所述修饰部分使纳米孔堵 塞。 本发明提供的方法避免了测序完成的文库大 量富集在纳米孔测序装置的反式(Trans)端， 并 进一步提高了反式(Trans)端改造的可变性。 权利要求书2页 说明书15页 序列表3页 附图3页 CN 114921533 A 2022.08.19 CN 114921533 A 1.表征目标多 核苷酸的方法， 包括： (a)使目标多 核苷酸穿过纳米孔移动， 其中， 所述目标多 核苷酸的测序终端包 含修饰部分， 所述 修饰部分使所述纳米孔堵塞； (b)随着所述目标多核苷酸相对于所述孔移动， 获取一个或多个电和/或光测量值， 其 中所述测量 值代表所述目标多 核苷酸的一个或多个特 征， 并由此表征 所述目标多 核苷酸。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中， 所述纳米孔包括固态纳米孔和/或生物纳米孔； 所述生物纳米孔包括跨膜孔； 所述跨膜 孔包括跨膜蛋白孔。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 还 包括： (c)使所述目标多 核苷酸相对于所述纳米孔反向移动， 回到所述纳米孔的起始侧。 4.根据权利要求3所述的方法， 其中， 步骤(c)不包括： 随着所述目标多核苷酸相对于所述孔移动， 获取一个或多个电和/或光测量值， 其中所 述测量值代表所述目标多 核苷酸的一个或多个特 征， 并由此表征 所述目标多 核苷酸； 和/或 步骤(c)中， 所述使所述目标多核苷酸相对于所述孔反向移动通过包括如下至少一种 方式实现： 施加反向电压， 原子力显微镜牵引和/或使 所述目标多核苷酸相对于所述纳米孔 反向移动的反向酶的牵引。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法， 其中， 步骤(a)包括： 将包含所述修饰部分的衔接体附接到所述目标多核苷酸， 以使所述目标多核苷酸的测 序终端包 含所述修饰部分； 和/或 所述修饰部分包 含侧链不带电荷或侧链带正电荷的修饰部分； 和/或 所述侧链不带电荷的修饰部分包括PNA、 多肽和磷酸骨架烷基化修饰的核苷酸中任一 种或任两种以上的组合； 和/或 所述侧链带正电荷的修饰部分包括磷酸骨架阳离 子寡聚物修饰的核苷酸； 和/或 所述阳离 子寡聚物包括精 胺、 亚精胺、 腐胺任一种或任两种以上的组合； 和/或 所述修饰部分包含相互结合的配基和配体， 所述配基和配体包括链霉亲和素和生物 素， 和/或 抗原和抗体。 6.根据权利要求5所述的方法， 其中， 所述衔接体为包含双链区和至少一个单链区的Y 型衔接体， 或 包含双链区并且不包 含单链区的E型 衔接体。 7.根据权利要求6所述的方法， 其中， 所述衔接体为Y型衔接体， 所述Y型衔接体的修饰 部分位于所述Y型衔接体的悬突部 分或所述Y型衔接体的修饰部 分形成所述Y型衔接体的悬 突部分； 和/或， 所述修饰部分共价地连接到所述Y型衔接体， 或所述修饰部分通过点击化学反 应连接到所述Y型 衔接体。 8.根据权利要求6所述的方法， 其中， 所述衔接体为E型衔接体， 所述修饰部分位于没有 附接至所述目标多 核苷酸的一端。 9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法， 其中， 所述衔接体包含阻断链， 所述阻断链 具有与所述多 核苷酸不同的结构， 用于阻滞马达蛋白。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921533 A 210.用于表征目标多核苷酸的衔接体， 其特征在于， 所述衔接体包含修饰部分， 所述修 饰部分用于结合到所述目标多 核苷酸的测序终端， 所述 修饰部分能够使纳米孔堵塞。 11.用于表征目标多 核苷酸的构建体， 所述构建体包 含衔接体， 和目标多 核苷酸； 所述衔接体包含修饰部分， 所述修饰部分结合到所述目标多核苷酸的测序终端， 所述 修饰部分能够使纳米孔堵塞； 所述目标多 核苷酸为双链多 核苷酸。 12.用于表征目标多核苷酸的复合物， 所述复合物包含衔接体或构建体， 和马达蛋白， 其中， 所述构建体包 含所述衔接体和目标多 核苷酸， 所述衔接体包含修饰部分， 所述修饰部分结合到所述目标多核苷酸的测序终端， 所述 修饰部分能够使纳米孔堵塞； 所述马达蛋白为能够结合到所述目标多 核苷酸并且 控制其移动穿过孔的蛋白。 13.根据权利要求12所述的复合物， 其中， 所述马达 蛋白选自聚合酶、 核酸外切酶、 解旋 酶和拓扑异构酶中的一种或多种； 所述解旋酶选自Hel308解旋酶、 RecD解旋酶、 Tral解旋酶、 TrwC解旋酶、 XPD解旋酶和 DDA解旋酶中的一种或多种。 14.用于纳米孔表征多 核苷酸的试剂盒， 所述试剂盒的组成包 含： 1)衔接体， 所述衔接体包含修饰部分， 所述修饰部分用于结合到所述目标多核苷酸的 测序终端， 所述 修饰部分能够使纳米孔堵塞； 和 2)马达蛋白。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921533 A 3