(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210559684.3 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 栾雨婷　赵大球　陶俊　许聪　 孙静　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 王艳 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 15/66(2006.01)A01H 5/02(2018.01) A01H 6/00(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) (54)发明名称 牡丹PsMYB4基因在改变植物花瓣色斑颜色 和大小方面的应用 (57)摘要 本发明公开了牡丹 PsMYB4基因在改变植物 花瓣色斑颜色和大小方面的应用。 所述牡丹 PsMYB4基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 本发明还公开了沉 默牡丹PsMYB4基因的载体、 表 达盒、 重组菌或细胞在改变植物 花瓣色斑颜色和 大小方面的应用。 本发明还公开了获得具有较大 花瓣色斑的牡丹的方法以及鉴定所述的方法获 得的具有较大花瓣色斑的牡丹的方法。 本发明通 过将构建的 PsMYB4基因沉默载体转化到牡丹花 瓣中进行表达， 待 花瓣生长 7天后， 观察 PsMYB4转 基因牡丹花瓣色斑表型， 发现色斑较野生型明显 变大， 色斑颜色明显加深， 色斑中总花青素含量 显著增加， 色斑中花青素生物 合成相关基因的表 达水平明显上升， 创制了具有较大花瓣色斑的牡 丹新种质。 权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图5页 CN 114836437 A 2022.08.02 CN 114836437 A 1.一种牡 丹PsMYB4基因， 其特 征在于， 所述基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO .1所示。 2.权利要求1所述的牡丹 PsMYB4基因编码的蛋白质， 其特征在于， 所述 蛋白质的氨基酸 序列如SEQ  ID NO .2所示。 3.克隆权利要求1所述的的牡丹 PsMYB4基因cDNA全长序列的扩增引物， 其特征在于， 所 述扩增引物的序列如SEQ  ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。 4.表达盒、 重组载体、 重组细胞或重组菌株， 其含有权利要求1所述的牡 丹PsMYB4基因。 5.根据权利要求4所的重组载体， 其特征在于， 所述重组载体包括基因沉默载体或过表 达载体。 6.权利要求1所述的牡丹 PsMYB4基因、 权利 要求4所述的表达盒、 重组载体、 重组细胞或 重组菌株、 权利要求5所述的重组载体在改变植物花 瓣色斑颜色和大小方面的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， 所述 植物为牡 丹。 8.权利要求5所述的重组载体的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 扩增权利要求1 所述的牡 丹PsMYB4基因片段， 并与双元表达载体TRV 2质粒连接即得。 9.获得具有较大花瓣色斑的植物的方法， 其特征在于， 使权利要求1所述的 PsMYB4基因 或权利要求5所述的基因沉默载体在植物花 瓣中表达 。 10.鉴定权利要求9所述的方法获得的具有较大花瓣色斑的植物的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1） 鉴定所述 植物是否包 含权利要求5所述的基因沉默载体； 或， 2） 测定所述 植物是否低丰度表达 权利要求2所述的牡 丹PsMYB4基因编码的蛋白。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836437 A 2牡丹PsMYB4基因在改变 植物花瓣色斑颜色和大小 方面的应用 技术领域 [0001]本发明属于植物生物技术领域， 具体涉及牡丹PsMYB4基因在牡丹PsMYB4基因在改 变植物花 瓣色斑颜色和大小方面的应用。 背景技术 [0002]牡丹(Paeonia  suffruticosa  Andr.)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia) 牡丹组(Section  Moutan)多年生木本植物， 是原产于我国的重要观赏植物和药用植物， 也 是我国传统 ‘十大名花 ’之一， 具有极高的观赏价值和经济价值。 部分牡丹品种花瓣基部存 在深色色斑， 除极具观赏价值外， 这一特性已成为牡丹品种识别和品种群分类的重要依据。 从颜色上分类， 色斑可以划分为深紫色、 红色和棕色3类(李嘉珏.中 国牡丹品种图志， 2005， 26‑39)； 从大小上分类， 可依据色斑在花瓣上的占比分为特大型、 大型、 中型和小型4类(赵 娜， 袁涛.西北牡 丹品种瓣基色斑形态的初步研究.中国农学通报， 2013， 2 9(16)： 19 2‑197)。 [0003]前人研究表明， 花青素是牡丹花瓣色斑颜色和大小的决定性色素群， 色斑中的花 青素包括以下六种， 分别为天竺葵素 ‑3‑O‑葡萄糖苷(pelargonidin ‑3‑O‑glucoside， Pg3G)、 天竺葵素 ‑3， 5‑O‑二葡萄糖苷(p elargonidin ‑3， 5‑di‑O‑glucoside， Pg3G5G)、 矢车 菊素‑3‑O‑葡萄糖苷(cyanidin ‑3‑O‑glucoside， Cy3G)、 矢车菊素 ‑3， 5‑O‑二葡萄糖苷 (cyanidin ‑3， 5‑di‑O‑glucoside， Cy3G5G)、 芍药花素 ‑3‑O‑葡萄糖苷(peonidin ‑3‑O‑ glucoside， Pn3G)和芍药花素 ‑3， 5‑O‑二葡糖苷(p eonidin‑3， 5‑di‑O‑glucoside， Pn3G5G) (Wang LS， Hashimoto  F， Shiraishi  A， Aoki N， Li JJ， Shimizu  K.Phenetics  in tree  peony species from China by flower pigment cluster analysis.Journal  of Plant  Research， 2001， 114： 213 ‑221； Wang  LS， Hashimoto  F， Shiraishi  A， Aoki N， Sakata   Y.Chemical  taxonomy  ofthe Xibei tree peony from China by floral  pigmentation.Journal  of Plant Research， 2004， 117： 47 ‑55； Zhang  JJ， Wang LS， Shu  QY， Liu ZA， Li CH， Zhang  J， Wei XL， Tian D.Comparison  of anthocyanins  in non‑ blotches  and blotches  ofthe petals ofXibei tree peony.Scientia  Horticulturae， 2007， 114： 104 ‑111)。 研究认为， 色斑 区细胞拥有远高于非斑 区细胞的花青素合成能力， 而 这一差异又涉及内外源环境因子、 结构 基因和调控基因的相互作用。 其中， 对于调控基因介 导的色斑形成， R2R3 ‑MYB家族转录因子是被研究的最为广泛的一大类(Quattrocchio  F， Wing JF， van der Woude K， Mol JN， Koes R.Analysis  of bHLH and MYB domain  proteins： Species  specific  regulatory  differences  are caused by divergent  evo  lution of target anthocyanin  genes.Plant  Journal， 1998， 13： 475 ‑488)。 目前， 文心兰 OgMYB1(Chiou  CY， Yeh KW.Differential  expression  of MYB gene (OgMYBl)determines   color patterning  in floral tissue ofOncidium  Gower Ramsey.Plant  Molecular   Biology， 2008， 66： 379 ‑388)、 东方百合LhMYB12(Yamagishi  M.Oriental  hybrid lily  Sorbonne  homologue  of LhMYB12regulates  anthocyanin  biosyntheses  in flower  tepals and tepal spots.Molecular  Breeding， 2010， 28： 381 ‑389)、 日本龙胆GtMYB3说　明　书 1/6 页 3 CN 114836437 A 3