ICS 07.100.99 CCS B41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2077—2021 动物垫料中志贺氏菌检测 Detection of Shigella in animal bedding 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2077—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：赵治国、延涵、盛万里、王海艳、陈林军、崔强、敖威华、李军燕、罗晓平、 韩祎陟、靳木子。 I DB15/T 2077—2021 动物垫料中志贺氏菌检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中志贺氏菌的分离鉴定定性检测方法。 本文件适用于动物垫料中志贺氏菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注： 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 厌氧培养装置 41.5 ℃±1 ℃。 均质器。 漩涡振荡器。 电子天平：感量 0.1 g，0.0001 g。 光学显微镜。 全自动微生物生化鉴定系统。 飞行时间质谱仪。 二级生物安全柜。 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 1 DB15/T 2077—2021 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 无菌滤膜均质袋。 pH 计。 无菌培养皿：15 mm×90 mm。 无菌试管：18 mm×180 mm。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌勺。 无菌玻片。 无菌棉签。 5 培养基和试剂 志贺氏菌常用培养基与试剂灭菌后保存期限参见附录C。 5.1 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 5.2 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录 A 中 A.2。 5.3 麦康凯（MAC）琼脂：见附录 A 中 A.3。 5.4 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.4。 5.5 志贺氏菌显色培养基。 5.6 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中 A.5。 5.7 营养琼脂：见附录 A 中 A.6。 5.8 半固体琼脂：见附录 A 中 A.7。 5.9 葡萄糖胺培养基：见附录 A 中 A.8。 5.10 尿素琼脂：见附录 A 中 A.9。 5.11 β-半乳糖苷酶培养基：见附录 A 中 A.10。 5.12 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.11。 5.13 糖发酵管：见附录 A 中 A.12。 5.14 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录 A 中 A.13。 5.15 粘液酸盐培养基：见附录 A 中 A.14。 5.16 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.15。 5.17 志贺氏菌生化鉴定试剂盒。 5.18 革兰氏阴性菌生化鉴定卡。 5.19 飞行质谱仪靶板。 5.20 志贺氏菌属诊断血清。 6 检验程序 志贺氏菌检验程序见图1。 2 DB15/T 2077—2021 样品制备 检样 25 g 或 25 cm2 样液+志贺氏菌增菌肉汤 225 mL 41.5 ℃±1 ℃，16 h～20 h 厌氧培养 XLD MAC 或志贺氏菌显色培养基 36 ℃±1 ℃，20 h～48 h 挑取可疑菌落 TSI，半固体，营养琼脂斜面 生化鉴定和/或全自动检测设备鉴定 报告 图1 志贺氏菌检验程序 7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末 状垫料样品，加入225 mL志贺氏菌增菌肉汤，充分振摇或均质1 min～2 min，于41.5 ℃±1 ℃，厌氧 培养16 h～20 h。 7.1.2.2 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cm5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去 棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重 复取样1～4个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25 mL～100 mL的无菌稀释液中，充分振摇制成样品 3 DB15/T 2077—2021 2 原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm ） ，取样量见表1。取25 mL样品原液加入225 mL 志贺氏菌增菌 肉汤，充分振摇或均质1 min～2 min。于41.5 ℃±1 ℃，厌氧培养16 h～20 h。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m 2 取样量 cm 规格板数 2 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 分离 取增菌后的志贺氏菌增菌肉汤分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基 平板上，于36 ℃±1 ℃培养20 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。若出现的菌落不典型或菌 落较小不易观察，则继续培养至48 h再观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表2。 表2 志贺氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 志贺氏菌菌落形态 MAC琼脂 无色至浅粉红色，半透明，光滑，湿润，圆形，边缘整齐或不齐。 XLD琼脂 粉红色至无色，半透明，光滑，湿润，圆形，边缘整齐或不齐。 志贺氏显色培养基 按照显色培养基的说明进行判断。 7.3 初步生化试验 7.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型菌落或可疑菌落，分别接种 TSI、半固体、营养琼 脂斜面各一管，至 36 ℃±1 ℃培养 20 h～24 h，观察结果。 7.3.2 凡是三铁塘琼脂斜面产碱、底层产酸、不产气（福氏志贺氏菌 6 型可产生少量气体） 、不产硫化 氢，半固体管中无动力的菌株，挑取 7.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验。 7.4 鉴定 7.4.1 生化鉴定 挑7.3.1培养的菌落进行志贺氏菌生化鉴定，具体操作依据志贺氏菌生化鉴定试剂说明书或附录B。 7.4.2 辅助鉴定 可根据实验室情况，选用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等对典型菌落或可疑菌落进 行鉴定，具体操作依据标准GB/T 33682和设备操作规范进行。 7.4.3 血清学鉴定 7.4.3.1 抗原的准备 4 DB15/T 2077—2021 志贺氏菌无鞭毛抗原，有菌体（O）抗原。菌体（O）抗原分为型和群的特异性抗原。 一般采用1.2 %～1.5 %琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 注1：一些志贺氏菌如果因为K抗原存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL生理盐水做成浓菌液，100 ℃煮沸 15 min～60 min去除K抗原后再检查。 注2：D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌抗原无交叉反应。宋内氏志贺氏菌粗 糙型菌株不一定会自凝，无K抗原。 7.4.3.2 凝集反应 在载玻片上划出两个约1 cm×2 cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于载玻片上的每一区域上 部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加1滴生理盐水，作为对照。用无菌接种环（针） 分别将两个区域的菌落研成乳状液。将载玻片倾斜摇动混匀1 min，并对着黑色背景进行观察，如果抗 血清中出现凝集成块的颗粒，而且生理盐水中没有出现自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水 中出现凝集，视为自凝，应挑取同一培养基上不同菌落继续进行试验。 若待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性，则按7.4.3.1注1进行试验。 8 结果报告 2 综合生化鉴定结果、辅助鉴定结果和血清学试验结果，报告25 g（cm ）动物垫料样品中检出或未 检出志贺氏菌。 9 生物安全措施 为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489 的有关规定执行。 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经121 ℃高压灭菌处理至少30 min后再弃置。 5 DB15/T 2077—2021 附 录 A （规范性） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 志贺氏增菌肉汤-新生霉素 A.2.1 志贺氏菌增菌肉 A.2.1.1 成分 胰蛋白胨 葡萄糖 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 氯化钠 吐温-80 蒸馏水 20.0 g 1.0 g 2.0 g 2.0 g 5.0 g 1.5 mL 1000 mL A.2.1.2 制法 将以上各成分混合加热溶解，冷却25 ℃左右调节pH 至7.0±0.2，高压灭菌121 ℃，15 min。冷却 至50 ℃～55 ℃，计入除菌过滤的新生霉素溶液（0.5 μg/mL），分装备用。 A.2.2 新生霉素溶液 A.2.2.1 成分 新生霉素 蒸馏水 25.0 mg 1000 mL A.2.2.2 制法 将新生霉素溶解于蒸馏水中，用0.22 μm过滤膜除菌。 A.3 麦康凯（MAC）琼脂 A.3.1 成分 蛋白胨 乳糖 3号