ICS 65.020.30 CCS B 44 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2050—2020 奶山羊性控冷冻精液制作操作规程 Code of practice on production of dairy goat frozen sexed-semen 2020-12-24 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2021-01-24 实施 发 布 DB15/T 2050—2020 前 言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件由内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司、内蒙古大学、内蒙古乐 科生物技术有限公司。 本文件主要起草人：李喜和、丁瑞、赵高平、王立志、袁鹏、曹贵方、王建国、朱士恩、胡树香、 孙伟、包花拉。 I DB15/T 2050—2020 奶山羊性控冷冻精液制作操作规程 1 范围 本文件规定了奶山羊性控精液生产的器械清洗和消毒、稀释液配制、采精、精液处理、精子分离、 冷冻、检验、包装、贮存及运输。 本文件适用于采用流式细胞分离技术生产奶山羊性控冷冻精液。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 20557 山羊冷冻精液 GB/T 31581 牛性控冷冻精液生产技术规程 GB/T 31582 牛性控冷冻精液 NY/T 1234-2006 牛冷冻精液生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 精子分离 sperm sorting 根据X精子和Y精子DNA含量的差异，利用流式细胞分离方法将X精子和Y精子分离开。 3.2 性控冷冻精液 frozen sexed-semen 分离后富含X或Y精子，经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液。 4 采精用品清洗和消毒 方法按照NY/T 1234 执行。 5 溶液配制与灭菌 5.1 溶液配制 5.1.1 精子稀释液配制 1 DB15/T 2050—2020 见附录A中 A.1。 5.1.2 精子分离用缓冲液的配制 见附录A中 A.2。 5.1.3 精子荧光染色液和食品红染色液配制 见附录A中 A.3。 5.1.4 精子染色原液配制 见附录A中 A.4。 5.1.5 精子收集液配制 见附录A中 A.5。 5.2 溶液灭菌 溶液在使用前进行高压蒸汽灭菌（120 KPa，20 min），对于不能高压灭菌的溶液使用0.22 ㎛过滤 器进行过滤除菌。 6 采精 6.1 准备 6.1.1 场地 采精场地应该保持平整、清洁、安静、遮光、无异味并进行定期消毒。 6.1.2 台羊 选择健康的母羊做台羊，并用保定架进行保定。 6.1.3 假阴道 假阴道安装前首先检查假阴道外壳、内胎是否有破损、裂缝和沙眼。将内胎的光滑面向里，放入外 壳内，使两端露出部分长度相当，将内胎漏出一端向外折叠置于对应外壳外则，另一端内胎外翻卷置 同一端外壳外侧，使内胎两端紧紧与外壳套牢，并用橡皮圈将两端扎紧固定。 用长柄镊子夹取75 %的酒精棉球，从内向外消毒内胎内壁，再用另一棉球消毒外壳上的内胎翻 边。待酒精挥发后备用。 假阴道夹层内注入温水，将消毒好的无菌集精杯安装在假阴道一端，用双连球向假阴道夹层内充 气至压力合适（用玻璃棒插入略有阻力）。用消毒纱布盖好放入 42 ℃恒温箱待用。采精前用玻璃棒醮 取少量润滑剂（凡士林油），均匀涂布于假阴道外口至内胎 1/3-1/2处。用温度计测量假阴道内的温 度，温度应为 38 ℃～41 ℃。 6.2 采精 种公羊采精前不宜饲喂过饱。并在采精前用干净的湿抹布对种公羊包皮及其周围进行擦拭，除去污 物，然后再进行采精。采精员蹲在台羊右侧后方，右手握假阴道，充气活塞向下，靠在台羊臀部，假 阴道和地面呈35度角。当公羊爬跨、伸出阴茎时左手轻托阴茎包皮，迅速将阴茎导入假阴道内。公羊 2 DB15/T 2050—2020 射精动作很快，公羊射精完毕后，随着公羊从台羊背部滑下时，顺势将假阴道取下，并立即将集精杯 的底端向下竖立，送操作室检查。采精时注意力应高度集中，动作应稳准快。 7 精液处理 7.1 颜色观察 观察集精试管中精液的颜色，正常的精液颜色为乳白色或浅黄色。 7.2 密度测定 用密度测定仪检测精液的密度。 7.3 活力测定 活力检测方法按照NY/T 1234-2006，7.3执行。 7.4 精液稀释 8 精子密度高于 6×10 个/mL，并且活力不小于 70 %可用于后续分离操作，密度、活力均合格的精 液使用奶山羊稀释液按体积比进行1:1等温稀释后，置于18 ℃～20 ℃的环境下保存待用。 8 精子分离 8.1 分离环境 精子分离实验室应保持洁净，室温控制在 18 ℃～22 ℃，无振动源。 8.2 分离前处理 根据所采原精密度，使用奶山羊专用染色液，按比例进行染色。 8 8 示例：对4×10 个精子进行染色，用奶山羊专用染色液稀释到2×10 个/mL,加入12 µL～25 µL H33342荧光染色液 放入5 mL分离专用试管，混匀后放入34 ℃水浴，加盖避光温育45 min。再加入2 mL 含4 %卵黄的食品红染色液，最后 制成精子分离样品。 8.3 分离 精子分离过程按照GB/T 31581执行。 分离精子收集液中添加奶山羊抗氧化剂 A和抗氧化剂 B。 8.4 分离精液冷冻保存 8.4.1 稀释平衡 分离后的精液在4 ℃±1 ℃条件下平衡90 min，然后4 ℃、850 g 离心20 min，去除上清液。用 20 %卵黄Tris-A液稀释收集后的分离精液，之后添加等量的含10 %甘油的Tris-B液，平衡20 min。用 7 1:1的Tris-A、Tris-B液将最终精子密度调整为每毫升不小于1×10 万个。 8.4.2 分装 3 DB15/T 2050—2020 平衡后的精液在4 ℃±1 ℃条件下灌装、封口、印字，在细管上打印生产单位代号、品种、奶山 羊号、生产日期或批号（见附录 B）、性控标记等信息。 8.4.3 冷冻、包装与保存 在4 ℃条件下将分装后的细管按照棉塞同一方向码放在冷冻架上，然后移入冷冻仪中，按照程序 控制冷冻仪操作规程操作，冷冻结束后进行包装，包装应在-140 ℃以下进行，置液氮中保存。 9 入库前检查 性控冻精产品的质量应由专职的质量检验员负责检测，每批性控冻精入库前应进行常规检验，方 法按照GB/T 31582进行。符合以下要求判定为合格，方可入库。 细管无裂痕，封口严密，标识清晰； 解冻后活力不小于40 %； 解冻后精子37℃体外存活时间4h活力不小于0.01； 6 前进运动精子数不小于1×10 个； 精子畸形率不大于20 %； 细菌数不大于800个。 10 贮存、运输 按照NT/T 1234—2006中13、14执行。 4 DB15/T 2050—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 奶山羊性控冷冻精液生产相关溶液配制 A.1 溶液配制 A.1.1 试剂纯度要求 所有试剂纯度需要达到AR级以上。 A.1.2 1000 mLTris-A工作液 取Trizma Base 35.32 g，柠檬酸17.21 g、D-果糖12.65 g溶于750 mL超纯水，搅拌30 min，再加 入超纯水定容至1000 mL。调节溶液pH值到6.8，然后用0.22 ㎛的过滤器过滤除菌，保存于5 ℃条件下 可供14 d内使用。 A.1.3 250 mL含20％卵黄的Tris-A液 取Tris-A液199 mL，添加51 mL卵黄液，搅拌15 min后置5 ℃条件下12 h析出沉淀。静置后吸出表 层卵脂，并在3850 g的条件下进一步离心沉淀。然后用0.22 ㎛的过滤器过滤除菌，加抗生素后保存在 5 ℃条件下可供7 d内使用。 A.1.4 1000 mL Tris-B工作液 取Trizma Base 35.746 g，柠檬酸19.980 g、D-果糖14.712 g、海藻糖18.4 g、BSA 3 g溶于750 mL 超纯水，搅拌30 min，再加入超纯水定容至1000 mL。调节溶液pH值到6.8，然后用0.22 ㎛的过滤器过 滤除菌，保存于5 ℃条件下可供14 d内使用。 A.1.5 250 mL含10％甘油的Tris-B液 以同样方法先配制含 23％ 卵黄的Tris－B工作液，然后添加甘油至 10％（v/v），调节Tris－B 液的pH值到 6.8，并加抗生素后在 5 ℃条件下保存，可供 7 d 内使用。 A.1.6 三联抗生素 配置好的稀释液分别按照泰乐菌素 6 mL/L（原液 19 mg/mL，v/v）、庆大霉素 8 mL/L（原液 99 mg/mL， v/v）、林可-奇霉素 6 mL/L（林可霉素原液 50 mg/mL，奇霉素原液 100 mg/mL，v/v）比例添加。 A.2 精子分离用缓冲液配制方法 配制 20L Tris-sheath工作液。取Trizma Base 477.6 g、柠檬酸 232.6 g、D-果糖 171.0 g溶于 3.0 L超纯水中搅拌 30 min，并加 1 mol/L盐酸把pH值调到6.8，然后添加抗生素,用 0.22 ㎛的过滤器 过滤灭菌，再加超纯水定容至 20.0 L，置 5℃冰箱保存可供 14 d 内使用。配好的Tris-sheath液的pH 值为6.8，渗透压为 290 mOsm ± 10 mOsm。 A.3 精子荧光染色液和食品红染色液配制方法 5 DB15/T 2050—2020 A.3.1 配制 10 mL荧光染色液 将10 mg荧光染料H33342定溶于 10 mL超纯水中，在5℃条件下避光保存。配好的荧光染色液使用期 限为 90 d。 A.3.2 配制100 mL食品红染色液 将5 g食品红染料溶于100 mL超纯水中，0.22 ㎛过滤除菌，在5℃条件下避光保存。配好的食品红 染色液使用期限为 90 d 。 A.4 精子染色原液配制方法 配制100 mL染色原液： 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 氯化镁（MgCl2•6H2O） 氯化钠（NaCl） 氯化钾（KCl） 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 碳酸氢钠（NaHCO3） 丙酮酸钠 葡萄糖 乳酸钠 牛血清白蛋白（BSA） 溶于100 mL超纯水中，并加入0.261 为7 d ～ 10 d。 0.925 g 0.008 g 0.5518 g