ICS 67.050 CCS B 50/59 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3367—2021 海洋生物体中皮质醇的测定 Determination of hydrocortisone in marine organism 2021 - 01 - 30 发布 辽宁省市场监督管理局 2021 - 03 - 02 实施 发 布 DB21/T 3367—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020给出的规则编写。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本文件主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院、大连海关技术中心、大连海洋学校 本文件主要起草人：刘桂英、王琦、葛坤、田金、宋广军、胡超魁、邵泽伟、李安龙 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅农产品质量安全监管局（沈阳市和平区太原北街2号综 合楼A座），联系人：马京京，联系电话：024-23447862；13840306249，电子邮箱：[email protected] 文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街50号） ，联系电话： 0411-84671027。 I DB21/T 3367—2021 海洋生物体中皮质醇的测定 1 范围 本文件规定了海洋生物体中皮质醇检测的原理、试剂、仪器和设备、样品前处理、样品测定与结果、 方法灵敏度、准确度和精密度。 本文件适用于鱼类、虾类、棘皮类、贝类生物体中皮质醇的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 30891 水产品抽样规范 3 方法原理 生物样品中的皮质醇，用0.2%甲酸乙腈溶液提取，固相萃取柱净化、浓缩，超高效液相色谱质谱 联用仪检测，外标法定量。 4 试剂 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 甲酸：色谱纯。 4.3 氯化钠：分析纯。 4.4 无水硫酸钠：分析纯。 4.5 0.1%甲酸溶液：用移液管量取 1 mL 甲酸，用水稀释并定容至 1000 mL。 4.6 0.2%甲酸乙腈溶液：用移液管量取 1 mL 甲酸，用乙腈（80%）稀释并定容至 500 mL。 4.7 标准品：皮质醇（hydrocortisone，C21H30O5，CAS 号 50-23-7，纯度 98% 以上）。 4.8 标准贮备溶液（10 mg/L）：准确称取 1.00 mg 皮质醇标准品，用乙腈稀释至 10 mg/L，避光贮存 在-18 ℃下。 4.9 标准溶液( 1 mg/L )：准确吸取标准贮备溶液 1 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容，避光冷 藏贮存于 2~6℃下。 4.10 针孔式微孔滤膜：0.22 μm，有机系。（亲水性聚丙烯、玻璃纤维、亲水性 PTFE、聚醚砜或其 它等效材质） 4.11 除非另有说明，在分析中所使用的水均符合 GB/T 6682 规定的一级用水。 5 仪器和设备 1 DB21/T 3367—2021 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 超高效液相色谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源、三重四级杆。 固相萃取装置：固相萃取柱，Captivate EMR（200 mg，6cc）。 离心机：转速：5000r/min。 分析天平：感量 0.0001 g 和感量 0.01 g。 高速组织捣碎机。 均质机。 氮吹仪。 涡旋混匀仪。 6 测定步骤 6.1 样品制备与保存 6.1.1 水产品的试样抽取：按 GB/T 30891 的规定执行。 6.1.2 水产品试样制备：取样品约 100 g，用高速组织捣碎机充分捣碎，均质机混匀，均分成 2 份， 一份用于检测，另一份作为留样。 6.1.3 样品于-18 ℃下冷冻避光存放。 6.2 提取 称取样品 5.00 g，置于 50 mL 聚丙烯塑料离心管中，加入 10 mL 的 0.2%甲酸乙腈溶液，充分摇匀， 涡旋，加入 1 g 的氯化钠和 4 g 的无水硫酸钠，充分涡旋混匀 1 min，超声 10 min，静置，以 5000 r/min 4 ℃ 离心 15 min，取上清液 4 mL，放入空的聚丙烯塑料离心管中，加入 1 mL 水，混匀，待净化。 6.3 净化和浓缩 将待净化溶液全部倒入固相萃取柱，保持约每秒一滴的流速，收集全部流出液(抽干)，45 ℃水浴浓 缩氮吹仪氮吹至液面高度恒定，用水定容至1 mL，上清液经有机滤膜0.22 µm过滤至进样瓶中，供超高 效液相色谱质谱联用仪检测。 6.4 样品测定 参照下述条件进行测定： －BEH C18 柱（2.1×50 mm i.d., 1.7 μm）； —流动相为 0.1% 甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱顺序见表 1； —进样量：10 μL； —柱温：30 ℃； —流速：0.2 mL/min。 表1 梯度洗脱顺序 时间（min） 0.1%甲酸水溶液（%） 乙腈（%） 初始 90 10 1.00 70 30 2.00 50 50 3.00 30 70 2 DB21/T 3367—2021 4.00 10 90 5.00 90 10 6.00 90 10 —电离模式电喷雾电离，正模式。 —扫描模式：多反应监测（MRM）模式，监测离子对（m/z）参见表 2。 表2 质谱条件 化合物 离子模式 分子离子对 驻留时间 锥孔电压 碰撞能量 m/z s V eV 0.163 42 22 42 16 ＊ ＊ 363.2>121 + 皮质醇 ESI 363.2>327 代表定量离子 6.5 标准曲线的绘制 吸取标准溶液（4.9）5 mL，用流动相逐级稀释，配制成浓度分别为0、5.0、10.0、20.0、50.0、 100 μg/L的混合标准系列工作溶液，将此混合标准系列工作溶液按色谱、质谱条件测定，通过仪器工 作站制定外标法标准曲线，标准溶液总离子流色谱图参见附录A。 6.6 分析 将样品溶液注入液相色谱质谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到样品溶液中皮质醇的质量浓度。 在同样测试条件下，样品溶液中皮质醇的保留时间与标准溶液中皮质醇的保留时间之间的偏差在± 2.5%以内，且样品溶液中皮质醇的定性离子的相对丰度与质量浓度相近的标准溶液中皮质醇的定性离子 的相对丰度一致，其丰度比偏差应符合表3的要求，则可判定样品溶液中存在被测化合物。 表3 定性离子相对丰度的最大允许偏差 定性离子相对丰度 >50% >20%＜50% >10%＜20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7 计算 试样中皮质醇的含量，按下列公式（1）计算，结果保留3位有效数字，符合GB/T 8170的数字修约 要求。 X= C  V 1000 m ........................................................................(1) X——试样中皮质醇含量，单位为微克每千克（μg/kg）； C——通过标准曲线计算的皮质醇浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V——试样最终定容体积，单位为毫升（mL）； m ——试样的称取量，单位为克（g）。 8 线性范围、灵敏度、精密度 3 DB21/T 3367—2021 8.1 线性范围 皮质醇标准溶液线性范围为0 μg/L～100 μg/L。 8.2 灵敏度 皮质醇的检出限浓度为0.11 μg/kg，定量限为0.35 μg/kg。 8.3 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的15%。 4 DB21/T 3367—2021 AA 附 录 A （资料性） 皮质醇总离子流色谱图 _________ B ____________ 5