ICS 65.020.20 CCS B 05 DB5117 四 川 省 （ 达 州 市 ） 地 方 标 准 DB5117/T 30—2020 达州黄花组织培养繁育技术规程 Technical Regulation Of Tissue Culture And Propagation For HemerocalliscitrinaBaroniOf DaZhou 2020-12-17 发布 达州市市场监督管理局 2020-12-17 实施 发 布 DB5117/T 30-2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由达州市农业农村局提出并归口。 本文件起草单位：达州市农业科学研究院。 本文件主要起草人：李益、胡振兴、杨小丽、高龙梅、吴明阳、张玲、刘小英、贾荟芹、李薇、邓 力、杨峰。 DB5117/T 30-2020 引 言 本文件第4.2.2章节—MS培养基配制，由于日常购买的白砂糖和琼脂质量存在差异，在规定浓度范 围内自行选择用量不影响最终结果。 本文件第4.3章节—不同培养阶段培养基配制，在愈伤诱导培养基、继代培养基、分化培养基和生 根培养基中加入70mg/L的抗菌剂，可减少杂菌污染的情况。生根培养基中加入2g/L的活性炭，可减少培 养过程中褐化的现象。 本文件第4.10.2章节—继代培养，需控制愈伤组织大小，将直径大于2cm的愈伤组织切成直径2cm 大小进行继代增殖。 本文件第5章节—炼苗，营养钵中基质成分及比例为泥炭土：珍珠岩：蛭石=1:1:1。 DB5117/T 30-2020 达州黄花组织培养繁育技术规程 1 范围 本文件规定了黄花组织培养繁育技术规程的术语和定义、组织培养繁育技术流程、炼苗的要求。 本文件适用于达州市行政区域内黄花的组织培养育苗。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 组织培养 tissue culture 在无菌培养基上，对植物离体器官、组织或细胞进行培养，以形成再生植株，或培养新的育种材 料的生物技术。 3.2 外植体 explant 生长在培养基上的被培养的器官、组织或细胞。 3.3 培养基 culture medium 为外植体的生长、发育提供所需物质的基质。 3.4 组培苗 tissue culture seedling 利用外植体，在无菌和适宜的人工条件下，采用植物组织培养技术，培育出的完整植株。 3.5 接种 inoculation 将外植体经消毒后，在无菌条件下植入培养基上的过程。 DB5117/T 30-2020 3.6 褐化 browning 在植物组织培养中，外植体由于自身分泌的酚类化合物被氧化产生褐色醌类物质，导致外植体褐 变的现象。 4 黄花组织培养繁育技术流程 4.1 实验室要求 黄花组织培养实验室应包括：药品室、洗涤室、准备室、缓冲室、接种室、培养室，配备完善的水、 电供应系统和空气、灯光、温度、湿度调节系统。 4.2 培养基配制 4.2.1 母液配制 按GB/T 603、GB/T 6682的规定执行。将培养基所需的大量元素、铁盐、有机成分配制成比使用浓 度高100倍的母液，微量元素配制成比使用浓度高1000倍的母液，均用棕色玻璃瓶保存，贴上标签，注 明母液号、配制倍数、日期，保存在冰箱冷藏室中。 4.2.2 MS 培养基配制 按GB/T 603、GB/T 6682的规定执行。配制MS培养基时将四种母液按比例混合后，加入白砂糖、琼 脂和水。所需白砂糖浓度为20g/L～30g/L，琼脂粉浓度为4g/L～6g/L。 4.3 不同培养阶段培养基配制 4.3.1 愈伤诱导培养基 MS + BA 3.0mg/L + NAA 0.1mg/L 4.3.2 继代培养基 MS + BA 2.0mg/L + NAA 0.1mg/L 4.3.3 分化培养基 MS + BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L 4.3.4 生根培养基 MS + NAA 0.1mg/L 4.4 培养基 pH 调节 黄花培养基最佳pH值为5.73～5.75。用酸度计测定pH，并用 1mol/LKOH或 1mol/L HCl调节。 4.5 培养基分装和灭菌 4.5.1 培养基分装 配制好的培养基趁热分装，培养基厚度1.5cm～2.5cm。分装后立即加盖或用封口膜封严，不同的处 理做好标记。 DB5117/T 30-2020 4.5.2 培养基灭菌 分装后的培养基进行高压灭菌处理，在0.8kPa～1.1kPa、121℃状态下保持20min。灭菌完毕后放入 接种室冷却待用。 4.6 培养室消毒 将培养室清扫干净，关闭门窗，按每立方米空间用高锰酸钾16g，福尔马林32ml，水16ml，放在瓷 瓦器皿中混合产生蒸气进行消毒，消毒时间10～12h。每隔15～20d消毒一次。 4.7 材料选取 选择春苗生长期健壮无病斑的黄花幼苗整株，切除根、叶部分，保留约8cm～10cm茎基段，用软毛 刷刷掉泥土后再用水冲洗30min。 4.8 材料消毒 在无菌操作台上先用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次。再用0.1%次氯酸钠浸泡5～8min, 用无菌水 冲洗3次，冲洗过程中不断摇晃放置材料的容器，去除消毒液残留。 4.9 剥离外植体和接种 在超净工作台上铺上无菌滤纸，用无菌镊子将茎基段剥开直至露出茎尖生长点，在20X的显微镜下 用无菌解剖针切取0.5mm茎尖1～2个，随即接种于黄花愈伤诱导培养基上，切口与培养基表面接触。每 剥一个茎段换一张无菌滤纸。 4.10 组培苗培养 4.10.1 愈伤诱导培养 将接种外植体的愈伤诱导培养基放置在培养架上进行愈伤诱导培养。温度 22℃～25℃，光照强度 800lx，光照时间10h/d。 4.10.2 继代培养 长出愈伤组织后，转接于继代培养基上进行增殖培养，每2-3周继代一次。温度22℃～25℃，光照 强度1500lx～2000lx，光照时间10h/d。 4.10.3 分化培养 选择致密型愈伤组织转接于分化培养基上进行不定芽的分化培养。温度22℃～25℃，光照强度 1500lx～2000lx，光照时间10h/d。 4.10.4 生根培养 将分化出不定芽丛的愈伤组织转接于生根培养基中进行生根培养，每瓶放3～5 株。温度22℃～25℃， 光照强度2000lx～2500lx，光照时间12h/d。 5 炼苗 当组培苗长出3～4条幼根，根系长度达到5cm～6cm时可开始炼苗。将培养瓶转移到大棚苗床上开盖 放置3～5d，用镊子取出小苗，洗去根部培养基，移栽到装有基质的营养钵中生长30～45d，炼苗时大棚 温度控制在15℃～25℃，湿度保持在45%～60%。 DB5117/T 30-2020 _________________________________