1ICS65.020.30 CCSB41 21 辽宁省地方标准 DB21/T3879—2023 动物弓形虫病荧光免疫层析试纸条检测技 术规程 Inspectionspecificationforfluorescentimmunochromatographicdectectionof toxoplasmosisinanimals  2023-11-30发布 2023-12-30实施 辽宁省市场监督管理局  发布 DB21/T3879—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：沈阳农业大学、辽宁伟嘉农牧生态食品有限公司。 本文件主要起草人：杨娜、桑晓宇、冯颖、刘攀峰、邓亮、陈冉、杨作丰、李红魁、范治斌、 薛英、李德臣、李佳祺、王英。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行 反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话： 024-23447862。 文件起草单位通讯地址：沈阳农业大学（沈阳市沈河区东陵路120号），联系电话：024-88487053。 DB21/T3879—2023 1动物弓形虫病荧光免疫层析检测技术规程 1范围 本文件规定了动物弓形虫病荧光免疫层析检测技术规程，包括规范性引用文件、原则、仪器与 试剂、样品采集与处理、检测、结果计算、判定标准。 本文件适用于动物（猪、猫等）血清中弓形虫抗体水平的快速检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原则 基于双抗原夹心荧光免疫层析法，将待检血清样品加入弓形虫荧光免疫层析试纸卡样品垫上， 通过虹吸作用沿层析条侧向流动，在检测区被检测，如果是阳性，则T线（注：T线为检测线）出 现条带；如果是阴性，则T线无条带；另外，如果C线（注：C线为质控线）出现说明试纸条是 有效的，否则无效。将试纸卡放入荧光免疫分析仪中，通过测定荧光信号强度，可以对抗体滴度进 行定量分析。 5仪器与试剂 5.1仪器 5.1.1荧光免疫分析仪 激发波长为365nm±5nm，检测波长为610nm±5nm。 5.1.2单道可调移液器 DB21/T3879—2023 210μL～100μL，0.5μL～10μL。 5.1.3分析天平 最小分度值为0.001g。 5.1.4离心机 离心速度3000rpm/min。 5.1.5冰箱 2℃～8℃，－20℃。 5.2试剂 5.2.1样品稀释液 见附录A。 5.2.2弓形虫荧光免疫层析试纸卡 荧光微球标记的弓形虫重组抗原和鸡IgY埋置在标记物垫内；硝酸纤维素膜（NC膜）的测试线 （T线）和控制线（C线）分别包被弓形虫重组抗原和羊抗鸡IgY的IgG（备注：荧光微球标记垫里需 要另外标记一种与弓形虫抗原无关的抗原物质，在此选用鸡的IgY，因此在硝酸纤维素膜上的控制 线位置就标记上抗鸡IgY的抗体IgG，IgY与IgG结合反应，C线就出现条带，说明试纸条是合格的）。 （见图1） 图1荧光免疫层析试纸卡结构 ①样品垫；②PVC底板；③待检血清样品；④标记物垫；⑤测试线（T线）；⑥控制线（C线）； ⑦NC膜（硝酸纤维素膜）；⑧吸水滤纸 6样品采集与处理 DB21/T3879—2023 36.1样品的采集 按照NY/T541中的规定进行，并做好安全防护。按常规方法用干燥、洁净的无抗凝剂的离心管 或适当容器采集3mL～5mL的血液。 6.2样品的处理 血液样本用离心机3000rpm/min离心3min～5min，分离血清，血清量不少于500μL。 6.3样品的贮存 血清样品在2℃～8℃条件下保存应小于24h。如需长期保存应置于－20℃条件下，避免 反复冻融。 7检测 7.1样本稀释 将弓形虫荧光免疫层析试纸和待检血清样品回温至25℃左右。将待检血清样本先用样品稀释液 进行3倍稀释，即1份待检血清样品与2份样品稀释液混合（例如，75μL待检血清样品与150μL 样品稀释液混合）。 7.2加样 将荧光免疫层析检测卡放于干净平坦的台面上，用移液器吸取已经稀释好的75μL待检血清样 本，垂直加样于检测卡的加样孔内。 7.3荧光检测 室温静置15min，立即采用荧光免疫分析仪检测，测定T线和C线荧光信号，读取分析仪显示数 值，该数值即为抗体效价。 7.4有效性控制 7.4.1空白对照 将荧光免疫层析检测卡放于干净平坦的台面上，用移液器吸取样品稀释液75μL于检测卡的加 样孔内，如果控制线（C线）检测到荧光信号，试验结果有效；否则，试验无效。 7.4.2阴性对照 DB21/T3879—2023 4将荧光免疫层析检测卡放于干净平坦的台面上，用移液器吸取稀释液稀释好的阴性血清75μL 于检测卡的加样孔内，如果控制线（C线）检测到荧光信号，试验结果有效；否则，试验无效。 7.4.3阳性对照 将荧光免疫层析检测卡放于干净平坦的台面上，用移液器吸取稀释液稀释好的阳性血清75μL 于检测卡的加样孔内，如果控制线（C线）和检测线（T线）检测到荧光信号，试验结果有效；否则， 试验无效。 8结果计算 An（n=1,2,3,4,5）-荧光免疫分析仪读取标准品溶液的检测卡上的荧光信号的T/C值。 以标准品溶液的T/C值的对数为纵坐标，以弓形虫抗体阳性血清效价的对数为横坐标，绘制标 准曲线图。将待测样本的荧光信号的T/C值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的样本的弓 形虫抗体效价。 注：软件自带计算功能，能准确算出当前样本荧光信号的T/C值所对应的弓形虫抗体效价。 9判定标准 被检血清抗体效价≥1:128时，判为阳性；被检血清抗体效价≤1:64时，判为阴性；被检血清 抗体效价1:64～1:128时，判为可疑。