ICS65.020.20 B05 黑龙江省佳木斯市地方标准DB23 DB2308/T182—2023 稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范 2023-12-11发布 2024-01-11实施 佳木斯市市场监督管理局 发布 DB2308/T182—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省佳木斯市农业农村局提出并归口。 本文件由黑龙江省佳木斯市市场监督管理局批准发布。 本文件起草单位：黑龙江省农业科学院水稻研究所。 本文件主要起草人：陆文静、周通、王桂玲、周雪松、韩笑。 本文件2023年首次发布。 DB2308/T182—2023 1稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范 1范围 本文件规定了稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）无毒基因检测PCR法技术规范。包括分子检测原理、 仪器设备、试剂及样品、防污染措施、实验步骤及结果分析。 本文件适用于黑龙江省佳木斯地区水稻稻瘟病菌无毒基因AVR-Pii、AVR-Pik、AVR-Pita、AVR-Piz-t、 AVR-Pia、AVR-Co39的PCR检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和缩略语 下列术语和缩略语适用于本标准。 3.1正向引物： 处于DNA双链上游的引物，简称F引物。 3.2反向引物： 处于DNA双链下游的引物，简称R引物。 3.3DNA： Deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。 3.4PCR： PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应 DB2308/T182—2023 23.5Goldenview： 核酸染料，替代溴化乙锭。 3.6DNAMarker： 标准分子量的核酸标记。 4原理 提取稻瘟病菌菌丝DNA，根据无毒基因保守区域序列设计特异性引物，对样品进行PCR扩增， 根据序列比对结果，依据是否扩增得到预期的DNA片段大小的序列来判断样品是否携带该无毒基因。 5仪器设备 电子天平、瓷质研钵、研杵、移液枪、水浴锅、高速离心机、核酸浓度测定仪（NanoDrop2000）、 基因扩增仪、琼脂糖电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统，其它相关仪器设备。 6试剂及样品 干燥的稻瘟病菌丝0.05g～0.1g、10%CTAB、5MNaCl、0.5MEDTA（pH8.0）、1MTris（pH 8.0）、1×TE缓冲液、氯仿：异戊醇（24：1）、75%乙醇、Goldenview等。 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和ddH2O或符合GB/T6682规定的一级水。 7实验过程防污染措施 检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。 8实验步骤 8.1稻瘟病菌菌丝DNA提取 取单孢培养后烘干的菌丝0.1g于研钵中加入液氮用研杵研磨，菌粉转入2mL灭菌离心管，并加 入65℃预热的DNA提取缓冲液700μL，盖盖混匀，置于水浴锅内65℃温浴1h（期间间隔15min 摇动混匀，使DNA提取缓冲液与菌丝充分混合，保证菌丝DNA的提取效率）。12000r/min离心10 min，取上清液600μL置于新的2mL离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24﹕1）振荡抽提5min～ 10min，12000r/min离心10min。缓慢吸取上清液500μL置于新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿： 异戊醇（24﹕1）振荡抽提5min～10min，12000r/min离心10min。缓慢吸取上清液300μL于新的 1.5mL离心管，加入900μL、-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置10min，12000r/min离心10min。 DB2308/T182—2023 3倒掉上清液，用75%乙醇洗涤沉淀3次，干燥后加入100μL1×TE缓冲液溶解，利用NanoDrop2000 测定提取DNA浓度，并用1×TE缓冲液稀释至100ng/μL，-20℃保存备用。 8.2PCR反应 8.2.1将DNA、PrimeSTARBuffer（5×）、dNTPMixture、正向引物（F）及反向引物（R）及ddH2O 置于冰上融化，引物序列参考附录A。 8.2.2在0.2mL加盖无菌离心管中，按先后顺序加入以下试剂： 混合后用移液枪抽打混匀，封盖后短暂离心待用。 8.2.3将离心管置于PCR仪中，反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃～61℃退 火30s，72℃延伸30s～60s（每对引物的退火温度及延伸时间参见附录A），29个循环，72℃总 延伸5min，4℃保存。 8.3电泳 用200mL玻璃烧杯称取琼脂糖0.5g，加入0.5×TBE缓冲液50mL。杯口用锡箔纸盖好封严，置 微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。待琼脂糖温度达到50℃左右时加入2.5μLGoldenview，混匀，迅速 将胶倒至模具中，放上样梳。约20min待胶完全凝固后，拔下上样梳，置于盛有0.5×TBE缓冲液的 电泳槽中。吸取5μLPCR反应液，上样130V，电泳0.5h～1.0h。电泳结束后，取下琼脂糖凝胶，利 用凝胶成像系统观察电泳条带大小，照相。 8.4PCR产物测序 使用试剂盒纯化25μLPCR产物，提交至生物技术公司测序。PrimeSTARBuffer（5×） 6μL dNTPMixture（2.5mM） 2.4μL 正向引物及反向引物（100nM） 0.2μL（终浓度：0.2μM～0.3μM） 样本DNA 1μL（20-100ng） ddH2O 20.1μL PrimeSTARHSDNAPolymerase（2.5U/μL） 0.3μL