ICS65.020.20 B05 黑龙江省佳木斯市地方标准DB23 DB2308/T184—2023 稻瘟病病菌单孢分离培养技术操作规范 2023-12-11发布 2024-01-11实施 佳木斯市市场监督管理局 发布 DB2308/T184—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省佳木斯市农业农村局提出并归口。 本文件由黑龙江省佳木斯市市场监督管理局批准发布。 本文件起草单位：黑龙江省农业科学院水稻研究所。 本文件主要起草人：王桂玲、陆文静、韩笑、周雪松、宋成艳。 本文件2023年首次发布。 DB2308/T184—2023 1稻瘟病病菌单孢分离培养技术操作规范 1范围 本文件规定了水稻稻瘟病菌分离所使用的仪器和用具、培养基去杂质方法及单孢分离培养程序和方 法等技术规范。 本文件适用于黑龙江省佳木斯市稻瘟病菌单孢分离技术。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB2308/T124-2022稻瘟病菌生理小种鉴定技术规程。 3术语和定义 3.1稻瘟病 由稻梨孢真菌引起的一种水稻病害，又称稻热病、火烧瘟、叩头瘟。病菌侵染叶片、茎秆、穗颈、 小穗梗和谷粒。根据受害时期和侵染部位不同，可分别引起苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟。 3.2单孢分离法 由单个孢子繁殖来获得纯菌种的方法。 4仪器和用具 4.1常用仪器 4.1.1超净工作台 洁净等级：100级@≥0.5um。平均风速：0.25m/s～0.6m/s。 4.1.2高压灭菌锅 温度范围：0℃～135℃，灭菌时间范围：4min～120min，最高工作压力：0.22MPa～0.25MPa。 4.1.3恒温培养箱 温度范围：0℃～50℃。温度波动：±1℃。光照度：0LX～7500LX。 4.1.4光学显微镜 DB2308/T184—2023 2目镜：10×；物镜：10×、40×。 4.1.5电子天平 感量0.01g。 4.2常用用具 剪刀、无菌载玻片、试管、接种针、培养皿、医用白瓷盘、滤纸、移液器、医用纱布、酒精灯、记 号笔，铗子。 5分离技术 5.1分离方法 悬挂震落法分离单孢菌株。 5.2培养基的配制 酵母淀粉培养基（淀粉10g、酵母粉2g、琼脂粉20g、蒸馏水1000mL）、琼脂培养基（琼脂 粉15g～20g、蒸馏水1000mL），在121℃湿热灭菌20min。 5.3培养基去杂质 琼脂质量的高低对单孢的分离有较大的影响。杂质少，培养基透明度高，孢子震落后在显微镜下易 于镜检，可提高挑取单孢效率，如果质量较差，需采用蛋白去杂的方法（每配制1000mL的培养基， 可用一颗鸡蛋的蛋清参混。方法是将琼脂粉煮化后，冷却至40℃～50℃，加入蛋清，并迅速用玻璃棒 搅动5min左右，使之成泡沫状，再重新加热煮沸，以此琼脂粉中的杂质附着于凝固的蛋白内，而后先 用1层～2层纱布，将大块蛋白滤除，再用7层纱布过滤，所得滤液即可装瓶灭菌备用。） 5.4病菌标样消毒 取新采集的1cm长的发病组织（节瘟或穗颈瘟）用75%酒精消毒（30s左右），然后用无菌水 冲洗。 5.5病菌标样培养 在干净的培养皿中放入1张滤纸或2层吸水纸，加入少量无菌水（浸湿吸水纸即可），把冲洗消 毒过的发病标样放在吸水纸上盖好后，放在26℃光照培养箱中培养1d～2d，标样表面就会产生深 灰色霉层（即孢子）。 5.6孢子震落 按照DB2308/T124-2022执行。 5.7单孢镜检 镜检时将培养皿反转放在显微镜的载物台上，在10×10倍的显微镜下查找稻瘟病菌孢子，同时 在其附近无其他孢子和杂菌存在时，用蘸水钢笔在单孢处轻轻点一墨水小圆点，以小圆点为中心画个小 圆圈，将点过的小圆点用洒精棉擦掉，再进一步检查所划圆圈内是否是单个孢子，确定无其它孢子后，