ICS 65.020.99 B 339 45 4 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 CCS DBB45/T 244 46—20222 反季季节秀 秀珍菇菇菌种 种制备 备技术术规程 程 Tecchnical code of practicee for process of f off-seaason Pleeurotus pulmmonarius culture e 2022 - 01 - 26 发布 发 广西壮 壮族自治区 区市场监督 督管理局 0 - 28 实施 实 2022 - 02 发 布 前 言 — DB45/T 2446 2022 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广西壮族自治区农业科学院提出并宣贯。 本文件由广西农业种植业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院微生物研究所、玉林市微生物研究所。 本文件主要起草人：陈雪凤、吴圣进、韦仕岩、卢玉文、郎宁、苏启臣、王灿琴、吴小建、陈国龙。 II — DB45/T 2446 2022 反季节秀珍菇菌种制备技术规程 1 范围 本文件界定了秀珍菇、反季节秀珍菇、种源的术语和定义，规定了制备环境、设施设备要求、质量 要求及种源组织分离、母种复壮与扩繁、原种、栽培种生产、杂菌及害虫的检验判定等各阶段的操作技 术要求。 本文件适用于广西行政区域内反季节秀珍菇菌种的制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728 食用菌术语 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 3 术语和定义 3.1 GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 秀珍菇 Pleurotus pulmonarius 在分类学上属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属；中文名：肺形侧耳种，商品名或俗 称凤尾菇、秀珍菇。子实体单生或散生，菌盖灰白至灰褐（黑）色。 3.2 反季节秀珍菇 off-season Pleurotus pulmonarius 种。 自然条件下冬季出菇的秀珍菇品种，通过人工调节栽培条件，能在夏季正常生产或栽培的秀珍菇品 3.3 种源 seed source 从野外或栽培场地采集，可以用来分离提纯繁殖材料的食用菌菌丝、子实体或孢子。 4 菌种制备环境 制备环境应符合NY/T 528的规定，用水应符合GB 5749的规定。 5 设施设备要求 1 — DB45/T 2446 2022 5.1 基本设施 冷却室、接种室、培养室应通风、洁净，可控温、控湿。 5.2 主要设备 应具备高压灭菌锅、超净工作台或接种箱、空调、除湿机、培养架、恒温培养箱、冰箱、显微镜等。 生产量大的菌种厂配备搅拌机、装瓶或装袋机。 6 菌种制作方法 6.1 总体技术要求 总体技术要求如下： a) 接种所需工具及环境要提前灭菌或消毒； b) 采用适宜的培养基； c) 接种操作全程要求无菌操作； d) 繁殖的每批菌种应做好生产记录； e) 菌丝培养期间温差应≤6 ℃； f) 每批菌种应贴有标签。 6.2 种源组织分离方法 6.2.1 种源采集时间 采集时间为5～6月，采集第1潮或第2潮菇。 6.2.2 种源要求 选择出菇快、均匀整齐、产量高且菇形完整、无病斑、无虫口、品种特征明显，不含杂质的秀珍菇 子实体。 6.2.3 分离培养基 采用 PSA 加富培养基（见附录 A）平板进行分离。母种培养基灭菌条件为 0.11 MPa（121℃）下灭 菌 30 min。 6.2.4 切块接种 用75％酒精对种源进行表面消毒后，将种源沿菌柄中心纵向掰成两半，用无菌解剖刀在菌盖与菌柄 交界处中心部位切取（4～6）mm×（4～6）mm菌肉组织接到平板上，于25 ℃～29 ℃恒温培养。 6.2.5 菌种纯化 组织块培养4 d～5 d，长出白色丝毛状菌丝体，检查淘汰有杂菌的菌落。选取菌丝健壮、洁白、均 匀的菌落，用接种铲取菌丝前端，移接到PSA综合培养基试管斜面，于27 ℃培养7 d～8 d，选取菌丝健 壮、洁白、均匀的试管斜面做为母种保存。 6.2.6 出菇试验观测 2 — 分离所得母种进行培养，栽培出菇试验重复3次，各项性状优良稳定的母种可进入生产使用。 DB45/T 2446 2022 6.3 母种复壮与扩繁技术 6.3.1 复壮 从冰箱取出保存的母种于25 ℃放置0.5 d～1 d后，用接种铲取（4～6） mm×（4～6）mm菌丝块接到 PSA加富培养基或淀粉加富培养基（见附录A）平板上，于25 ℃～29 ℃培养5 d～6 d，观察接种点菌丝 情况，挑出无杂菌、菌丝健壮、洁白、整齐的菌落作为母种进行扩繁。 6.3.2 扩繁 用接种铲切取健壮菌落前端菌丝块移接到PSA综合培养基试管斜面，于27 ℃恒温培养6 d～8 d，菌 丝长满斜面后，即可用于生产。菌种扩繁移植传代次数不宜超过3代。 6.3.3 检查 母种扩繁培养期间，应逐支正反面全面检查2次，剔除污染、长势差、色泽异常的菌落。 6.4 原种、栽培种生产技术 6.4.1 生产时间 原种生产时间宜安排在10月下旬～11月，栽培种生产时间宜安排在11月～12月。 6.4.2 培养基容器要求 培养基容器应满足以下要求： a) 盛装容器应耐高压（0.15 MPa）、耐高温（126 ℃～130 ℃）； b) 原种用玻璃瓶盛装、栽培种用聚丙烯塑料袋盛装； c) 瓶子体积宜 500 mL～750 mL，塑料袋为聚丙烯塑料袋，规格(13 cm～15 cm)×(26 cm～28 cm) ×0.06 cm； d) 塑料颈圈、棉塞或无棉塑料盖，能满足滤菌和透气要求； e) 棉塞应符合 NY/T 528 规定。 6.4.3 培养基制作 培养基配方（见附录 A）。阔叶木屑、棉籽壳、桑枝屑应于前一天预湿，麦麸、轻质碳酸钙、石 灰等装袋前加入并拌均匀。原料含水量为 58％～62％，pH 值为 7～8。 6.4.4 灭菌 培养基配制好后，在4 h内进行装袋并高压灭菌，保持压力0.14 MPa～0.15 MPa（温度为126 ℃～ 128 ℃），维持2 h～2.5 h。 6.4.5 冷却和接种 待瓶（袋）料温冷却至 30 ℃以下即可接种。用无菌接种勺（镊子）先去掉母种前端或原种表面老 菌块，再进行接种。接种量为 1 支母种接 5～6 瓶原种，750 mL 原种接 45～55 袋栽培种。菌种块要紧 贴培养料。 6.4.6 培养 3 — 接种后，原种、栽培种放置无菌培养室培养。培养室宜黑暗，温度稳定在25 ℃～27 ℃，空气相对 湿度60％～70％。 DB45/T 2446 2022 6.4.7 检查 菌种培养期间至少进行3次逐瓶（袋）检查，即接种后3 d～4 d菌丝未封面前、菌丝长至瓶（袋）身 1/3～1/2处、菌丝长至瓶（袋）身2/3至满瓶（袋）前各检查1次，清理菌丝生长异常或污染的瓶（袋）。 6.4.8 菌种存放 合格的菌种放在4 ℃～6 ℃下避光保存，保存期限1个月。 7 质量要求 7.1 感官要求 7.1.1 容器要求 瓶（袋）应完整，无损，棉塞、塑料盖应干燥、洁净、松紧适度，应符合透气和滤菌要求，无霉点 霉斑。 7.1.2 容积要求 母种培养基灌入量为试管总容积的1/5～1/4，顶端距棉塞40 mm～50 mm。原种、栽培种培养基上表 面距瓶(袋)口的距离45 mm～55 mm。 7.1.3 菌种外观 母种菌丝应长满斜面，原种、栽培种菌丝应长满瓶或袋。菌丝体洁白、色泽一致、均匀健壮、舒展、 浓密、菌落边缘整齐，无角变，无抑制拮抗线，无杂菌菌落，无菌丝分泌物。原种、栽培种培养物表面 分泌物允许有少量无色或透明浅黄色水珠，不能有黄色或黄褐色水珠，原种、栽培种原基总量不超过5％。 7.1.4 培养基外观 培养基不干缩，无积水、颜色均匀、无暗斑、无色素。 7.1.5 气味 有秀珍菇菌种特有的清香味，无酸、臭、霉等异味。 7.2 菌丝生长速度 在25 ℃～29 ℃下培养，母种6 d～8 d长满斜面，原种、栽培种25 d～32 d长满瓶或袋。 8 杂菌及害虫的检验及判定 8.1 杂菌检验及判定 8.1.1 感官检测 若出现以下三种情况之一，则判定为有杂菌污染： a) 培养物表面有光滑、湿润的粘稠物； 4 — DB45/T 2446 2022 b) c) 在棉花塞、胶塞、瓶颈接口处或培养基面上有与正常菌丝颜色不同的杂菌斑点； 打开菌种瓶、袋或试管塞，有酸、臭等异味。 8.1.2 镜检 在培养物异样部位取少量菌丝体制片，于显微镜下观察，若有不同形态菌丝或孢子存在的，判定为 杂菌污染。 8.1.3 培养检测 细菌培养检测：取菌种上、中、下三个部位黄豆粒大小的菌块，接入 15 mL～20 mL 三角瓶肉 汤培养基中，在 28 ℃～30 ℃条件下振荡培养 1 d～2 d，观察培养液是否混浊，若培养液混浊则判定有 细菌污染。 8.1.3.2 霉菌培养检测：取菌种上、中、下三个部位黄豆粒大小的菌块接到 PDA 平板上，在 28 ℃～30 ℃ 条件下培养 3 d～5 d，观察菌丝颜色、菌丝长势、菌落特征、有无杂菌孢子产生等。 8.1.3.1 8.2 害虫检验及判定 检菌种的不同部位取出少量培养物，放于白色搪瓷盘上，均匀铺开，在放大镜或解剖镜下观察 是否有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫。 从待 5 DB45/T 24446—2022 A A 附 录 A （规范性） 常用 培养基及配方 A.1 母种培 培养基 A.1.1 NY 5099规定的基质适用于本 本文件。 A.1.2 PSAA综合培养基 基：去皮马铃薯200 g，蔗 蔗糖20 g，琼脂 脂20 g，磷酸 酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0 0.5 g，蒸 馏水1 000 mmL，pH=6.5～ ～7.5。 A.1.3 PSAA加富培养基 基：去皮马铃 铃薯200 g，蔗 蔗糖20 g，蛋 蛋白胨2 g，磷 磷酸二氢钾1. 0 g，硫酸镁 镁0.5 g, 琼脂20 g，蒸 蒸馏水1 0000 mL，pH=6.5 5～7.5。 A.1.4 淀粉 粉加富培养基 基：去皮马铃 铃薯200 g，可 可溶性淀粉20 g，蛋白胨2 g，磷