ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3280.1—2018 病毒微生物农药 棉铃虫核型多角体病毒 第1部分：棉铃虫核型多角体病毒母药 Virus-basedinsecticides-—Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus(HearNPV)- Part 1 :Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus technical concentrate(TK) 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3280.1—2018 前言 NY/T3280《病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒》分为3个部分： 第1部分：棉铃虫核型多角体病毒母药； 一第2部分：棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂； 第3部分：棉铃虫核型多角体病毒悬浮剂。 本部分为NY/T3280的第1部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业农村部农药检定所、武汉中科威睿农业科技有限公司、中国科学院武汉病毒 研究所。 本部分主要起草人：孙修炼、王晓军、肖凤平、杨峻、类承凤、张忠信、郭明程。 行业标准信息服务平台 I NY/T3280.1—2018 病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒 第1部分：棉铃虫核型多角体病毒母药 1范围 本部分规定了棉铃虫核型多角体病毒母药的要求、试验方法、产品的检验与验收以及标志、标签、包 装、储运、安全和保质期。 R 2规范性引用文件 月文 日期的版本适用于本文 少 件。凡是不注日期的引用文代其最新版本 适用于本 农药pH值的测定方法 GB/T 1601 商品农验收规则 GB/T1604 GB/T160 商品农药采样方法 农药包装通则 GB3796 GB 4789. GB/T6682 分析实验 室用水规格和试验 GB/T8170 数值修 规则与极限数 CENTER GB/T16150 1995 农药粉剂可湿 GB 20813 药产品 农 3 术语和定义 3. 1 棉铃虫核型多角体病毒每药 NPV)technicalcon- centrate(TK) ，有效含量为棉铃虫核型多 角体病毒的含量，通常情况 以棉铃虫核型多角体病毒包涵体为主安 还会包含伴随病毒扩增而产生的宿主昆虫或细胞的生物组分。 3. 2 病毒包涵体polyhedralinclusionbody（PiB 病毒水平传播的主要载体形式，其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的多角体中。 3.3 生测效价比 potencyratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验，比较样品、标准品引起的生物反应测定药物效价或 其生物学活性。 3. 4 菌落形成单位 colonyformingunits(CFU) 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过 一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 1 NY/T3280.1—2018 3.5 杂菌菌落总数numberofmicrobialcontaminants 将棉铃虫核型多角体病毒母药样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上，所得到的微生物（真菌和细 菌)菌落数之和。 4要求 4.1外观 通常为灰白色或褐色均匀粉状物，无可见机械杂质，不应有结块；或者灰白色或褐色液体，存放过程 中可能出现沉淀，经搅动能恢复原状，不应有结块。 4.2规范项目及指标 棉铃虫核型多角体病毒母药还应符合表1的要求。 表1棉铃虫核型多角体病毒母药控制项目指标 项目 指标 病毒包涵体数量，PIB/g或PIB/mL ≥100亿 生测效价比（标准品LCso/待测样品LCso），% ≥80.0 杂菌菌落总数，CFU/g或CFU/mL ≤1.0X107 pH 5.0~7.5 （固体）干燥减量，% 细度（通过75μm标准筛），% >95.0 5试验方法 5.1一般规定 除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液，试验用水为GB/T6682中规定 的三级水。 5.2抽样 按GB/T1605中固体制剂采样”“液体制剂采样”方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件，最 终抽样量应不少于200g（mL）。 5.3PCR扩增及DNA测序法对病毒毒种的鉴定 通过提取试样中病毒DNA作为模板，用HearNPVme53基因和dbp基因的特异性引物进行PCR 扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测。当PCR扩增片段大小约为0.5kb时，回收扩增片段，并克隆到T载 体上，用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序，将测序结果分别与棉铃虫核型多角体病毒（G4 株）的me53基因和dbp基因序列进行比对分析，试样与HcarNPV(G4株）的me53基因及dbp基因的 一致性均应大于98%，即认定试样中的病毒为棉铃虫核型多角体病毒。 棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述参见附录A。棉铃虫核型多角体病毒毒种的鉴定的方法按照 附录B的规定。 5.4病毒包涵体含量的测定 5.4.1方法提要 称取少量的病毒试样，用定量的水稀释成水悬浮液，并稀释至适当倍数后，滴加在血球计数板上在 光学显微镜下计数。根据血球计数板上病毒包涵体的数量以及稀释倍数，计算出单位质量（体积）病毒 的数量。 5.4.2仪器、设备 分析天平：精确至0.0001g。 2 NY/T 3280.1—2018 微量移液器：0.1mL~1mL。 容量瓶：10mL。 光学显微镜。 血球计数板及专用盖玻片。 5.4.3测定步骤 5.4.3.1将试样充分振荡摇匀后，准确称取一定量的试样（精确到0.0002g）置于10mL容量瓶中，加 水稀释至刻度，取此悬液稀释成适当浓度的悬浮液（最终稀释液使每小格有2个～4个病毒包涵体）。 计数时，将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用微量移液器吸取稀释后的病毒悬 十数室，防止产生气泡，充人悬液的量以不超过 液，滴于盖玻片边缘，让悬液自行缓缓渗人， 次性充活 计数池，每个计数池选取4角 个中大格 十数病毒包酒体的总 和取其平均值即为计数 及正中央5个中方格，计 结果。 U 5.4.4计算 试样中棉铃虫核型多角体病毒包涵体合量X S ........(1) 式中： 或PIB每毫升 Xi A 计数室各 病毒包涵体总数的平均值，单位为 B 样 品稀释 升（mL ，液体）或宅 CEN 4X106 80 十数 小方 5.4.5允许差 作为测 病毒包涵体含量2 定结果、 5.5生测效价比的测定 生测效价比（标准 的测 5.6杂菌菌落总数的测定 按GB4789.2的规定执行 5.7pH的测定 按GB/T1601的规定执行。 服务平台 5.8干燥减量的测定 5.8.1仪器、设备 分析天平：精确至0.001g。 扁形称量瓶：直径40mm。 电热干燥箱：控温范围（50℃~200℃），误差士2℃。 干燥器。 5.8.2试验步骤 将称量瓶在（105土2)℃电热恒温干燥箱内烘至恒重（精确至0.001g）。称取试样10.0g（精确至 0.001g），置于预先称重的称量瓶中，放人（105土2)℃的电热恒温干燥箱内干燥，1h后取出，在干燥器 中冷却至室温，称重。 3 NY/T3280.1—2018 5.8.3测定结果 干燥减量Xz按式（2)计算。 X2 = (2) m 式中： X2 一干燥减量，单位为百分率（%）； m 试样的质量，单位为克（g）； mi 干燥后试样的质量，单位为克（g）。 5.8.4允许误差 2次平行测定结果之差，应不大于0.5%，取其算术平均值作为测定结果。 5.9细度的测定 按GB/T16150—1995中2.2的规定执行。 6产品的检验与验收 应符合GB/T1604的规定。极限数值处理采用GB/T8170中的修约值比较法。 7标志、标签、包装、储运、安全和保质期 7.1标志、标签 7.2包装 应符合GB3796和GB20813中的有关规定。 7.3储运 棉铃虫核型多角体病毒母药包装件，应在10℃以下的避光环境中储运。储运过程中应有遮避装 置，严防日晒和潮湿。 7.4安全 在使用说明书或包装容器上，除有相应的毒性标志外，还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救 措施。 7.5保质期 在规定储运条件下，棉铃虫核型多角体病毒母药的质量保证期从生产日期算起为2年。2年保质 准信息服务平台 期内，生测效价比和病毒包涵体数量不低于4.2中的指标。 4 NY/T 3280.1—2018 附录A （资料性附录） 棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述 A.1中文通用名称 棉铃虫核型多角体病毒。 A.2拉丁文学名 HelicoverpaarmigeraNucleopolyhedrovirus，简称HearNPV。 A.3生物学分类 杆状病毒科、Alpha杆状病毒属。 A.4生物学特性 A.4.1形态结构：基本毒粒为杆状，毒粒有囊膜，囊膜内含有一个杆状的核衣壳，核衣壳中含有病毒基 因组。病毒颗粒被包藏在蛋白晶体内形成包涵体（PIB）。光学显微镜下观察，PIB呈强折光性的颗粒； 电子显微镜下观察，PIB呈多面体形状，直径0.5μm~15μm之间。 A.4.2分子结构：杆状病毒基因组为双链、环状DNA分子。 A.4.3包涵体生物学特征：包涵体可以保护病毒颗粒，包涵体非常稳定，对细菌、热和许多化学物质包 括低pH有抵抗，使其在土壤中可以存活多年。 A.4.4宿主范围及传播机理 本产品系通过自然界中分离棉铃虫核型多角体病毒毒株，使其在活体宿主昆虫中扩增、分离纯化而 成