ICS65.060.99 CCSB90T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ160—2023 水产品中四种硝基呋喃类代谢物的快速 检测胶体金免疫层析法 Rapiddetectionoffournitrofuranmetabolitesinaquaticproducts Colloidalgoldimmunochromatographicmethod 2023-01-18发布 2023-02-18实施 浙江省农产品质量安全学会发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ160—2023 1前  言 本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会归口管理。 本文件起草单位：浙江省水产技术推广总站。 本文件主要起草人：柯庆青、王鼎南、李诗言、周钦、何辉、王扬、沈清、孔俏丹、丁雪燕、吴洪 喜。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ160—2023 2水产品中四种硝基呋喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法 1范围 本文件规定了水产品中四种硝基呋喃类代谢物的胶体金免疫层析快速检测方法。 本文件适用鱼、虾、蟹、鳖、贝、蛙等水产品中肌肉组织中3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ，呋喃唑酮 代谢物）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ，呋喃它酮代谢物）、氨基脲（SEM，呋喃西林代 谢物）、1-氨基-2-乙内酰（AHD，呋喃妥因代谢物）的快速测定。 2规范性引用文件 下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20752猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联 质谱法 GB/T30891水产品抽样规范 3术语及定义 本文件没有需要界定的术语和定义 4原理 样品中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检 测卡/试纸条中检测线（T线）上硝基呋喃类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅 的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中硝基呋喃类代谢物进行定性判定。 5试剂和材料 除特殊注明外，本文件所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的二级水。 5.1试剂 5.1.1乙酸乙酯（C4H8O2）。 5.1.2正己烷（C6H14）。 5.1.3无水硫酸钠（Na2SO4）：650℃灼烧4h，冷却后贮于密闭干燥容器中备用。 5.1.42-硝基苯甲醛（C7H5NO3）。 5.1.5二甲亚砜[(CH3)2SO]。 5.1.6无水磷酸氢二钾（K2HPO4）。 5.1.7盐酸（HCl）。 5.1.8氯化钠（NaCl）。 5.1.9二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）。 5.1.10十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ160—2023 35.1.11表面活性剂S17[C18H35O(CH2CH2O)n-H]。 5.2溶剂配制 5.2.1盐酸溶液：量取盐酸（5.1.7）18mL，用水定容至1000mL，混匀，配置成0.2mol/L盐酸溶液。 5.2.2衍生化试剂：取2-硝基苯甲醛（5.1.4）160mg，用二甲亚砜溶解并稀释至10mL，混匀，现配现 用。 5.2.3磷酸氢二钾溶液：取无水磷酸氢二钾（5.1.6）174.2g，用水溶解并定容至1000mL，混匀，配置 成1mol/L磷酸氢二钾溶液。 5.2.4复溶液：磷酸盐缓冲液（10mmol/L），称取8.0g氯化钠（5.1.8）、2.77g十二水合磷酸氢二钠 （5.1.10）、0.352g二水合磷酸二氢钠（5.1.9），10g表面活性剂S17（5.1.11），用水溶解并定容至1 L，过滤，经121℃灭菌15min。 5.3参考物质 硝基呋喃代谢物药物标准物质，中文名称、英文名称、CAS登记号、化学分子式、相对分子量见 表1，各组分纯度≥99%。 表1硝基呋喃类代谢物标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量 中文名称 英文名称 CAS登录号 化学分子式 相对分子量 3-氨基-2-恶唑烷酮3-anmino-2-oxazolidinone, AOZ80-65-9 C3H6N2O2 102.09 5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷 基酮5-morpholine-methyl-3-ami no-2-oxazolidinone,AMOZ43056-63-9 C8H15N3O3 201.22 1-氨基-2-乙内酰脲盐酸盐1-Aminohydantoin hydrochloride,AHD2827-56-7 C3H5N3O2·HCl 151.55 氨基脲盐酸盐semicarbazidhydrochloride, SEM563-41-7 NH2CONHNH2·HCl111.53 5.4标准溶液的配制 5.4.1标准储备液（100mg/L）：分别准确称取适量硝基呋喃代谢物标准物质（5.3）10mg（精确至0.0001 g），用乙腈溶解并定容至100mL容量瓶中，配制成100mg/L的标准储备液，-18℃冷冻避光保存， 有效期12个月。 5.4.2混合中间标准溶液（1mg/L）：准确移取标准储备液（5.4.1）各1mL于100mL容量瓶中，用乙 腈定容至刻度，配制成浓度为1mg/L的混合中间标准溶液，4℃冷藏避光保存，有效期3个月。 5.4.3混合标准工作溶液（0.01mg/L）：准确移取0.1mL混合中间标准溶液（5.4.2）于10mL容量瓶 中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为0.01mg/L的混合标准工作溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1 个月。 5.5材料 5.5.1快速检测试纸条（含金标微孔）：呋喃唑酮代谢物检测试纸条、呋喃它酮代谢物检测试纸条、呋 喃西林代谢物检测试纸条、呋喃妥因代谢物检测试纸条，密封包装，按产品要求保存，即开即用。 6仪器 6.1电子天平：感量0.01g和0.0001g。 6.2均质机：转速不小于8000r/min。 6.3离心机：转速不小于4000r/min。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ160—2023 46.4氮气吹干仪或空气吹干仪：加热温度不小于60℃。 6.5恒温水浴锅：加热温度不小于70℃。 6.6旋涡振荡仪：转速0r/min～3000r/min。 6.7微量移液器：10μL～100μL，100μL～1000μL。 6.8胶体金读数仪（必要时）。 7测定步骤 7.1抽样 按照GB/T30891要求进行抽样，参考表A.1填写采样信息记录。 7.2试样制备 鱼、虾、蟹、鳖、贝等水产品按照GB/T3089附录B规定进行制样，将试样分成检样和备样两份， 并做标记，每份不少于50g。蛙类去头、皮、内脏，取肌肉部分放入高速研磨仪中高速研磨，直至成肉 糜的状态（特殊要求除外）。检样立即检测或-18℃以下冷冻待测，备样-18℃以下冷冻保藏，保存期 不超过3个月。 注：虾、蟹的壳、触角和节肢不得在制样过程中混入试样。 7.3水解与衍生化 称取试样2.00g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入5mL0.2mol/L盐酸溶液（5.2.1）和0.5mL 衍生化试剂（5.2.2），漩涡混合30s，置于70℃的水浴中孵育15min。 7.4提取与净化 取出离心管冷却至室温，加入4mL1mol/L磷酸氢二钾溶液（5.2.3）混合均匀，加入7mL乙酸乙酯 （5.1.1）和5g无水硫酸钠（5.1.3），振荡提取3min后4000r/min离心3min，取上层液体3mL于5mL带 盖离心管中，60℃下水浴氮气流吹干；向吹干的离心管中分别加入2mL正己烷（5.1.2）和0.5mL样品 复溶液（5.2.4），旋紧离心管盖，上下颠倒20次后4000r/min离心3min（或静置至明显分层），待测。 7.5测定 取出四种硝基呋喃代谢物免疫胶体金快速检测卡（试纸条）和金标微孔（5.5.1），并恢复至适宜工 作温度（20℃±5℃）。分别吸取7.4中待测液下层溶液100μL于金标微孔中，反复抽吸至金标完全溶解， 静置孵化3min。吸取100μL混匀液滴于检测卡加样孔中并反应5~8min，并在2min内读取结果。 注：不同试剂盒制造商间的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。 7.6质控试验 每批样品应同时进行空白、阴性和阳性对照质控试验。 7.6.1空白试验 每批样品需做一组空白对照，以复溶液（5.2.4）代替试样提取液，按7.5进行。 7.6.2阴性对照 称取同类基质空白试样，按7.3、7.4和7.5步骤进行操作。 7.6.3阳性对照 全国团体标准信息平台 T/ZNZ160—2023 5准确称取同类基质空白试样2.00g（精确至0.01g），置于50mL离心管中，加入适量硝基呋喃代谢 物混合标准溶液（5.4.3），使试样中四种硝基呋喃代谢物含量分别达到检出限或2倍检出限，按7.3、7.4 和7.5步骤进行操作。 8结果判断及表述 可使用胶体金读数仪对结果进行判读，具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视 法对结果进行判读时，判定方法见8.1节和8.2节。 8.1比色法 8.1.1无效检测试纸条：如控制线（C线）不出现红色条带（如图1-1），说明检测试纸条失效，不能 进行检测。 8