ICS 11.120.01 CCS C27 团 体 标 准 T/TPPA 000 4-2022 DPPH法评价中药注射剂体外抗氧化活性 操作规程 Operating procedure for evaluating of traditional Chinese medicine injection antioxidant capacity in vitro by DPPH method 2022-12-22发布 2022-12-22实施 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0004-2022 目 次 前 言 ................................ ................................ ............. I 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 检测原理 ................................ ................................ ........... 1 5 材料与设备 ................................ ................................ ......... 2 5.1 材料 ................................ ................................ ........... 2 5.2 设备 ................................ ................................ ........... 2 6 实验方法 ................................ ................................ ........... 2 6.1 溶液配制 ................................ ................................ ....... 2 6.2 实验步骤 ................................ ................................ ....... 3 7 数据处理及判定 ................................ ................................ ..... 4 7.1 吸光度变化量的计算 ................................ ............................. 4 7.2 IC50的计算 ................................ ................................ ..... 4 7.3 RAA的计算 ................................ ................................ ..... 4 7.4 精密度的计算 ................................ ................................ ... 5 7.5 体外抗氧化活性的评价 ................................ ........................... 5 天津市医药行业协会 发布 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0004-2022 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由天津天士力之骄药业有限公司提出。 本文件由天津市医药行业协会归口。 本文件起草单位：天津天士力之骄药业有限公司 、天津市药品检验研究院 、天津市中药注射剂安全 性评价企业重点实验室 、创新中药关键技术国家重点实验室 、 现代中医药海河实验室 、河南天地药业 股份有限公司 、天津红日药业股份有限公司 。 本文件主要起草人：鞠爱春、周军、张磊、岳洪水、李莉、张俊华、周水平、周立华、郑文科、郑 新元、苏小琴、尚献召、李兵、苏亚芹、何毅、白晓丽、江昕、张松梅。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0004-2022 1 DPPH法评价中药注射剂体外抗氧化活性操作规程 1 范围 本文件规定了 DPPH法评价中药注射剂体外抗氧化活性的要求。 本文件适用于具有自由基清除能力的中药注射剂体外抗氧化活性的评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 33087 仪器分析用高纯水规格及试验方法 《中华人民共和国药典》 2020年版 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 抗氧化 antioxidant 某些物质可以通过直接作用于自由基，或通过间接消耗可生成自由基的物质，而达到有效抑制自由 基氧化的反应。 3.2 半抑制浓度 half maximal inhibitory concentration ，IC50 阳性对照或供试品的加入使反应溶液较相同浓度的 2,2-联苯基-1-苦基肼基（ 2,2-Diphenyl -1- picrylhydrazyl ，DPPH）控制溶液吸光度下降 0.500时，对应的反应溶液中阳性对照或供试品的浓度。 3.3 相对抗氧化活性 relative antioxidant activity ，RAA 单位浓度供试品溶液使 DPPH控制溶液吸光度下降与单位浓度阳性对照溶液使 DPPH控制溶液吸光度 下降的比值。 4 检测原理 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0004-2022 2 DPPH是一种较为稳定的、以氮为中心的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在 517nm附近有强吸收。当 有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使 DPPH乙醇溶液光吸收减弱。 DPPH乙醇溶液褪色程度与 其接受的电子数呈线性关系，由此可评价供试品清除自由基的能力，即用 IC50评价抗氧化活性的大小， 并通过与阳性对照（ L-抗坏血酸）抗氧化活性的比较，得到 RAA，以评估不同供试品（如品种、批次等） 的抗氧化活性。 5 材料与设备 5.1 材料 5.1.1 耗材 a）96孔微孔板（透明平底聚苯乙烯微孔板，带盖板，孔容积 360µL）。 b）按扣盖聚丙烯微量离心管（ 2mL、5mL）。 5.1.2 试剂试药 a）乙醇和 DPPH均为分析纯。 b）L-抗坏血酸为标准物质。 c）水为GB/T 33087 规定的仪器分析用高纯水。 5.2 设备 电子分析天平、酶标分析仪、漩涡混合器、暗箱。 6 实验方法 6.1 溶液配制 6.1.1 DPPH 溶液的配制 取DPPH适量，精密称定，加乙醇适量，混合均匀，即得。临用现配，遮光保存。 6.1.2 DPPH 控制溶液的配制 精密量取 DPPH溶液适量（体积同 V1），加入乙醇适量（体积同 V2）稀释制成目标浓度（ 浓度可以参 考为每1mL含DPPH 60µg）混合均匀，即得， 临用现配 。 6.1.3 阳性对照 系列浓度溶液的配制 精密称取 L-抗坏血酸适量，加高纯水溶解并稀释，混合均匀，制成系列浓度溶液（至少配制由高到 低不少于 5个浓度水平，其浓度水平可以参考为每 1mL含L-抗坏血酸 20µg、15µg、12.5µg、10µg和5µg）， 临用现配。 6.1.4 阳性对照 系列浓度本底溶液的配制 全国团体标准信息平台 T/TPPA 0004-2022 3 精密量取相同体积的上述浓度水平的阳性对照贮备溶液（体积同 V2）置于离心管底部，分别精密加 入乙醇（体积同V1），混合均匀，置于暗箱反应，即得，临用现配。 6.1.5 阳性对照系列浓度反应溶液的配制 精密量取相同体积的上述浓度水平的阳性对照贮备溶液（体积同 V2）置于离心管底部，分别精密加 入DPPH溶液（体积同V1），混合均匀，置