ICS 67.050 CCS X 83 中 国 营 养 保 健 食 品 协 会 团 体 标 准 T/CNHFA 131—2023 斑马鱼模型用于保健食品辅助降血脂功能的 筛查方法 Screening Method for Auxiliary Lipid -lowering Function of Health Food with Zebrafish Model 2023-05-30 发布 2023-06-01 实施 中 国 营 养 保 健 食 品 协 会 发 布 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 131—2023 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规定起草。 本文件由杭州环特 生物科技股份有限公司提出。 本文件由中国营养保健食品协会归口。 本文件起草单位：杭州环特生物科技股份有限公司、北京东方红航天生物技术股份有 限公司、东阿阿胶保健品有限公司、漳州片仔癀药业股份有限公司、广西壮族自治区亚热 带作物研究所、浙江养生堂天然药物研究所有限公司、广东太阳神集团有限公司、新时代 健康产业集团、云南云科特色植物提取实验室有限公司、广东青云山药业有限公司、浙江 方格药业有限公司、健合（中国）有限公司、华熙生物科技股份有限公司、黑龙江飞鹤乳 业有限公司、完美（广东）日用品有限公司、云南贝泰妮生物科技集团 股份有限公司、中 食都庆（山东）生物有限公司、首都医科大学附属北京中医医院、北京市药品检验研究院、 上海疾控中心。 本文件主要起草人：朱晓宇、徐懿乔、谢瑶、孙阳恩、陈志亮、檀小辉、唐秀观、张 正方、刘婷婷、史珅、杨怡雯、 缪着、徐霄龙、范妙璇、杨文良、洪新宇。 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 131—2023 2 斑马鱼模型用于保健食品辅助降血脂功能的筛查方法 1 范围 本文件规定了采用斑马鱼模型对保健食品降血脂功能的筛查方法。 本文件不适用于筛查不能溶解、乳化或制备成均匀分散的悬浮液的受试样品。 2 规范性引用文件 GB/T 39649 实验动物 实验鱼质量控制 GB/T 21807 化学品 鱼类胚胎和卵黄囊仔鱼阶段的短期毒性试验 术语和定义 试验溶液 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 斑马鱼 Zebrafish 脊椎动物，生物分类学上属于脊椎动物门、硬骨鱼纲、鲤鱼目、鲤科、斑马鱼属、斑 马鱼种，可用于教学和科研的模式动物。 3.2 受精后天数 Day(s) Post -fertilization, dpf 受精卵受精后的天数。 3.3 无可观察效应浓度 No Observed Toxic Effect Concentration, NOEC 与模型对照相比，对试验生物未产生显著 毒性效应的最高受试样品浓度。 4 原理 通过饲喂斑马鱼高糖高脂饲料（葡萄糖和蛋黄粉）可形成脂代谢紊乱斑马鱼模型，同 时给予斑马鱼受试样品，可检测受试样品对高甘油三酯血症和高胆固醇血症的影响，并可 判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响。本试验用油 红O对斑马鱼甘油三酯进行染色，用体视显微镜拍摄斑马鱼尾静脉并用图像处理软件计算 光密度总和，光密度总和与斑马鱼体内的甘油三酯含量呈正相关，甘油三酯含量越高，光 密度总和越大；用胆固醇荧光探针对斑马鱼胆固醇进行染色，用荧光显微镜拍摄斑马鱼尾 静脉并用图像处理软件计算荧光强度总和，荧光强度总 和与斑马鱼体内胆固醇的含量呈正 相关，胆固醇含量越高，荧光越强。根据斑马鱼体内甘油三酯、胆固醇的含量来判定受试 样品是否具有辅助降甘油三酯或辅助降胆固醇功能。 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 131—2023 3 5 试剂和材料 5.1 胆固醇荧光探针 胆固醇荧光探针 用二甲基亚砜配制成 1 mg/mL 母液， -20℃储存。推荐斑马鱼静脉注射 剂量为 2 ng/尾（每尾斑马鱼注射 2 nL浓度为 1 mg/mL的胆固醇荧光探针）。 5.2 油红 O 油红 O用丙二醇配制成浓度为 5 mg/mL染液备用，常温储存。 5.3 高脂饲料（蛋黄粉溶液） 蛋黄粉用标准稀释水配制 15%溶液，超声 10 min，使用时用标准稀释水进行稀释，终 浓度为 0.15%。 5.4 高糖饲料（葡萄糖溶液） 葡萄糖用标准稀释水配制 30%溶液，使用时用 标准稀释水 进行稀释 ，终浓度为 3%。 5.5 3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐 （C9H11NO 2.CH 4O3S，MESAB） 将MESAB与Na2HPO 4· 12H 2O以1:5的总质量比混合，配制成 4 mg/mL 溶液，放置在 4℃ 储存。使用时用标准稀释水进行稀释，终浓度为 0.16 mg/mL 。 5.6 甲基纤维素 甲基纤维素用超纯水配制成体积分数为 3%的液体胶状物 ：将甲基纤维素 缓慢加入沸水 中，边加边搅拌，甲基纤维素完全溶解后，继续搅拌至冷却到室温；用锡箔纸密封烧杯口， 放置在 4℃储存。 5.7 标准稀释水 配制方法见附录 A。 5.8 阳性对照药 阿托伐他汀钙 用二甲基亚砜配成 11.6 mg/mL 溶液，超声 10 min后， 12000 g，10 min离 心取上清， -20 ℃分装储存。使用时终浓度为 11.6 μg/mL 。 5.9 漂白液 甲酰胺 200 μL，柠檬酸钠缓冲液（ 20×）200 μL，30%H 2O2 1.3 mL，加入 2.3 mL超纯水， 常温储存。 5.10 柠檬酸钠缓冲液（ 20×）（ pH 7.0） NaCl 175 g ，柠檬酸钠 88 g，加入 1 L超纯水，常温储存。 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 131—2023 4 6 仪器和设备 6.1 生化培养箱 带有温控和进风装置，温度控制范围 5 ℃~50 ℃ ，精度 ±0.1 ℃。 6.2 电子天平 分度值为 0.0001 g。 6.3 水质检测设备 盐度计（电导率测定仪）、硬度计、 pH计、溶解氧测定仪 。 6.4 体视显微镜 6.5 体视荧光显微镜 需配有红色荧光通道。 7 试验准备 7.1 斑马鱼胚胎准备 按照 GB/T 39649 的规定执行斑马鱼质量控制。 使用野生型 AB品系斑马鱼。 在体视显微镜下挑选每孔 30尾发育正常的 5 dpf斑马鱼胚胎，置于 50 mL烧杯中进行孵 育，水温控制在 26-28.5 ℃。 7.2 受试样品储备液制备 按照表 1的方法对不同类型受试样品进行前处理。受试样品储备液宜用标准稀释水配制， 受试样品难以用水溶解时可考虑使用助溶剂或分散剂。推荐的溶剂： 丙酮、乙醇、甲醇、 二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、三甘醇。适合的分散剂：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐温 80、 0.01%的纤维素甲醚、聚氧乙烯化氢化蓖麻油。 表1 不同类型受试样品前处理方法 样品类型 前处理方法 原料类 依次经过粉碎、提取、超声、均质等步骤制得受试样品 固体类 颗粒剂 依次经过粉碎、溶解、超声、均质制得受试样品 片剂 依次经过去除包衣、内容物粉碎、溶解、超声、均质制得受试样品 硬胶囊 依次经过去除胶囊壳、内容物粉碎、溶解、超声、均质制得受试样品 粉剂 依次经过溶解、超声、均质制得受试样品 硬糖/软糖 依次经过粉碎、提取、溶解、超声、均质制得受试样品 袋泡茶 依次经过加热水、提取、溶解制得受试样品 液体类 直接稀释的方式溶解得到受试样品 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 131—2023 5 8 试验程序 8.1 暴露条件 8.1.1 造模 选取发育正常的 5 dpf 斑马鱼，置于 50 mL烧杯中，每烧杯 30尾斑马鱼，用标准稀释水 定容至 25 mL。5 dpf早上 9:30给予斑马鱼高脂饲料，下午 17:00在标准稀释水中用筛网将高 脂饲料洗脱 3次，更换为高糖饲料，孵育过夜。在斑马鱼 6 dpf早上 9:30，在标准稀释水中用 筛网将高糖饲料洗脱 3次。重复 5 dpf相同的方式，给予斑马鱼高脂、高糖饲料处理。在斑马 鱼7 dpf早上 9:30，在标准稀释水中用筛网将高糖饲料洗脱 3次，将烧杯中的斑马鱼转移至 6 孔板，结束暴露。 8.1.2 给药 在斑马鱼 5 dpf早上 9:30在给予高脂饲料的同时给予受试样品，下午 17:00在高脂饲料洗 脱后给予高糖饲料的同时给予受试样品，孵育过夜。在斑马鱼 6 dpf，重复 5 dpf 相同的方式， 给予斑马鱼受试样品处理。在斑马鱼 7 dpf 早上 9:30，在标准稀释水中用筛网将高糖饲料洗 脱3次，将烧杯中的斑马鱼转移至 6孔板，结束暴露。给药持续时间为 48 h。如果受试样品 富含营养物质，试验溶液容易