ICS65.020.20 CCSB05 21 辽宁省地方标准 DB21/T3717—2023 李、杏品种鉴定SSR分子标记法 2023-04-30发布 2023-05-30实施 辽宁省市场监督管理局  发布 DB21/T3717—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本文件起草单位：辽宁省果树科学研究所。 本文件主要起草人：刘硕、刘宁、刘威生、章秋平、张玉萍、马小雪、张玉君、徐铭、赵海娟、刘 家成。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。 文件起草单位通讯地址：辽宁省果树科学研究所（辽宁省营口市鲅鱼圈区熊岳镇铁东街），联系电 话：0417-7033462。 DB21/T3717—2023 1李、杏品种鉴定SSR分子标记法 1范围 本文件规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记法进行李（Plum）、 杏（Apricot）品种鉴定的主要仪器设备与试剂耗材、试剂配制、参照种质、操作步骤、基因型对比、 结果判定等要求。 本文件适用于利用SSR分子标记指纹对比快速鉴定李、杏种质资源。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则 GB/T19557.30植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南梨 GB/T30988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法 GB/T30989-2014高通量基因测序技术规程 GB/T37870个体鉴定的高通量测序方法 NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则 3术语和定义 NY/T2594界定的术语和定义适用于本文件。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对（Basepair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammoniumammoniumbromide） ddH2O：重蒸馏水（Distilledanddeionizedwater） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid） Hi-Di：去离子甲酰胺（Highlydeionizedformamide） nt：碱基（Nucleotide） PCR：多聚酶链式反应（Polymerasechainreaction） PVP：聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone） TE：Tris-EDTA缓冲液（10mMTris，1mMEDTA，pH8.0） 5原理 DB21/T3717—2023 2李、杏的不同种质资源，其基因组存在着能够进行稳定遗传的简单重复序列SSR的重复次数差异。 这种差异可以通过从抽取具有代表性的检测样品种提取DNA，利用SSR引物进行扩增和电泳，通过检测其 扩增产物片段大小加以区分。 6主要仪器设备与试剂耗材 高速离心机、分光光度计等主要仪器设备，氯仿、异戊醇等试剂，移液枪配套枪头、枪头盒等耗材， 具体见附录A。 7试剂配制 试剂配制方法见附录B。 8SSR引物 用于李、杏品种鉴定的优异SSR引物有45对，见附录C。退火温度55℃-57℃。 9参照品种 参照品种见附录D。 10操作步骤 10.1样品准备 受检及参照李、杏品种样品均采集幼嫩叶片，按照GB/T30988-2014，8提取步骤改良。每份待测 品种和参照品种选取3个单株进行混合分析。于春季分别自每个样株上采集新鲜、幼嫩、健康的叶片两 片（约1g）混合置于离心管，做好标记置于液氮中浸泡后，保存于-80℃冰箱。 10.2DNA提取 采用改良CTAB法提取李、杏样品DNA；或利用植物基因组DNA提取试剂盒依照说明书进行提取。在通 风环境或通风橱进行提取。改良CTAB法DNA提取步骤如下： a)将液氮冷冻后的叶片样品放入研钵中磨成粉末，然后迅速将0.2g左右粉末转入2mL离心管中， 加入65℃预热的CTAB提取液600μL，（加入适量PVP粉末或1%的β-巯基乙醇溶液），充分混匀 1min后置于65℃水浴锅中50min，每隔5min摇荡1次； b)取出离心管置于冰上10min，然后置于4℃高速离心机中，12000rpm离心15min。使用移液枪取 上清液至新1.5mL离心管中； c)加入20μg/μLRNA消化酶10μL并摇晃均匀，随后置于37℃培养箱消化60min； d)取出离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）后，充分混匀，室温下静置10min，离心机12000 rpm离心15min； DB21/T3717—2023 3e)取上清液500μL置于新的1.5mL离心管中。加入1.0mL的-20℃冰乙醇溶液，轻轻摇晃，置于-20℃ 冰箱60min或4℃过夜； f)取出离心管并置于4℃高速离心机中，12000rpm离心30min，弃上清，利用75%乙醇洗涤沉淀两 次，管口向下置于室温下自然晾干； g)加入100μLTE溶液溶解DNA沉淀，待完全溶解后利用核酸测定仪检测DNA浓度和纯度，将DNA 浓度稀释至20ng/μL，置于-20℃冰箱保存。 注：其他所获DNA质量能够满足后续PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本文件。 10.3PCR扩增 10.3.1PCR反应体系 总体积20μL。包括DNA模板5μL（20ngμL），上游荧光引物1μL（10nM），下游普通引物1μL（10μM）， 2×TaqDNA聚合酶Mix10μL，ddH2O3μL。 10.3.2PCR反应程序 PCR反应程序如下： a)95℃变性5min； b)95℃变性30s； c)依照附录C推荐的引物退火温度退火30s； d)72℃延伸45s； e)重复b-d步骤35个循环； f)72℃延伸10min； g)PCR产物置于4℃保存。 10.4PCR扩增产物检测 10.4.1PCR产物纯化 将PCR扩增产物置于96孔PCR板进行纯化操作，步骤如下： a)20μLPCR产物加入5μL5M的NaCl（终浓度0.5M）； b)加入25μL24％的PEG8000溶液（终浓度12％），混匀； c)置于室温30min； d)置于离心机4500xg，4℃离心30min后，立即将板反扣在厚的吸水纸上，离心至150xg，去除上 清； e)加入70μL75％乙醇，4500g，4℃离心15min，立即将板反扣在厚的吸水纸上，离心至150g， 去除上清，重复一次； f)50℃或室温干燥，加入10μLddH2O溶解，即为纯化的PCR产物。 10.4.2毛细管电泳上机样品制备 DB21/T3717—2023 4毛细管电泳上机样品制备，步骤如下： a)每份纯化后的PCR产物取1μL于新的96孔PCR板中，每份样品加入0.5μL内标（GS500LIZ）及 50μL的Hi-Di稀释液，剧烈震荡5min，使内标充分混匀； b)将96孔平板放入PCR仪中，95℃加热5min，程序结束后迅速放在冰上冷却2min。做好上机表后， 在ABI3730DNA测序仪进行检测。 11基因型对比 每个样品SSR位点的等位变异以扩增产物峰值大小的形式表示。使用Genemapper4.0软件读取 ABI3730检测的等位基因峰图（图1，图2，图3），依照软件说明书整理每对引物在每份品种中扩增产物 峰值的保留时间并记录在EXCEL表格中，汇成基因型矩阵。根据待测品种与参照品种的SSR等位基因长度、 位点和与杂合特性，确定是否有差异。 图1三种杏品种4种荧光SSR引物检测峰图