ICS 65.020.01 CCS B 16 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 2956—2023 马铃薯干腐 病菌PCR检测方法 Detection of pathogenic fungus for potato dry rot by PCR method 2023-04-26发布 2023-05-26实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2956 —2023 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 原理 ................................ ................................ ............... 1 5 试剂与仪器 ................................ ................................ ......... 1 试剂 ................................ ................................ ........... 1 溶液配制 ................................ ................................ ....... 1 仪器 ................................ ................................ ........... 2 6 操作步骤 ................................ ................................ ........... 2 对照的设立 ................................ ................................ ..... 2 取样 ................................ ................................ ........... 2 马铃薯组织样品 DNA提取 ................................ ......................... 2 PCR扩增 ................................ ................................ ........ 2 7 琼脂糖凝胶电泳 ................................ ................................ ..... 3 8 结果 ................................ ................................ ............... 3 试验成立的条件 ................................ ................................ . 3 结果判定 ................................ ................................ ....... 3 DB15/T 2956 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区马铃薯标准化技术委员会（ SAM/TC 40 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区产品质量检验研究院、内蒙古中加农业生物科技有限公司、乌兰察 布市检验检测中心、内蒙古朱日和镇综合保障和技术推广中心。 本文件主要起草人：刘晓权、赵莉、张键、吕文霞、高俊、齐桂敏、任玮、赵欣、孙翠翠、孙辉远、 姜涛、王斌、常青、李燕、田艳花、包美丽、刘广晶、连普琛、俎爱忠、毕晓宇、董林峰、李建青、姬 媛琦、陈曦、胡越然、王勐。 DB15/T 2956 —2023 1 马铃薯干腐病菌 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了马铃薯干腐病菌 PCR检测方法 。 本文件适用于马铃薯块茎中干腐病菌 的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 马铃薯干腐病 potato dry rot 由镰刀菌属（ Fusarium spp.）真菌引起的病害。 该病在马铃薯生长期和贮藏期均可发生，主要危 害块茎，病斑多发生于薯块脐部。发病初期薯块表面出现黑褐色凹陷病斑，随后扩大形成轮纹状褶皱； 后期薯块内部变空，整个薯块变硬、变轻、干缩，呈灰褐色或深褐色，干燥时薯块内部长满白色菌丝； 湿度大时发病处变红呈糊状。 4 原理 本文件采用聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ，PCR）方法检测马铃薯干腐病菌。其原 理是：以马铃薯干腐病菌保守序列设计特异性引物，以基因组 DNA 为模板，在 Taq DNA聚合酶的作用下 进行PCR扩增， 根据 PCR扩增结果判断该 样品中是否含有目的片段， 从而达到鉴定马铃薯干腐病菌的目的。 5 试剂与仪器 试剂 5.1.1 以下所有试剂，除另有规定外，均使用分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 中规定的一级水。 5.1.2 植物基因组提取试剂盒、 2×Taq PCR Master Mix 、无水乙醇、 50×TAE电泳缓冲液、溴化乙锭、 DNA Marker 、6×DNA Loading Buffer 等均从试剂公司购买。 溶液配制 DB15/T 2956 —2023 2 5.2.1 1×TAE电泳缓冲液 量取50×TAE电泳缓冲液 20 mL，加水定容至 1 L。 5.2.2 1.5%琼脂糖凝胶 称取1.5 g琼脂糖， 加入 100 mL的1×TAE电泳缓冲液， 微波炉加热至琼脂糖融化， 待溶液冷却至 50 ℃ 左右时，加入 5 μL溴化乙锭溶液，摇匀，倒入制胶板中均匀铺板，凝固后取下梳子，备用。 5.2.3 溴化乙锭溶液（ 10 mg/mL ） 称取溴化乙锭 100 mg，加水溶解，定容至 10 mL。 仪器 PCR仪、台式高速离心机（离心力 1180 g～12470 g）、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、 移液器、高压蒸汽灭菌锅、 4 ℃冰箱、普通天平（感量 0.01 g）。 6 操作步骤 对照的设立 检测体系以马铃薯干腐病菌的 DNA作为阳性对照，以不添加 DNA模板的反应体系作为阴性对照。 取样 一块地取发病马铃薯块茎组织，将样品保存于 4 ℃冰箱中， DNA提取时将马铃薯块茎组织切成 0.1 g 见方小块，样品需现用现取。 马铃薯组织样品 DNA提取 将样品置于灭过菌的研钵中，加液氮研磨成粉末，转至 1.5 mL离心管，利用植物基因组 DNA提取试 剂盒提取。 PCR扩增 6.4.1 PCR扩增引物 以核糖体 5.8S rDNA 和28S rDNA 基因的间隔序列 ITS:（Intergenic Transcribed Spacer ）设计引 物，引物序列如下： 上游引物：5’-TTGGTTGTAGCTGGTCTATTT -3’。 下游引物： 5’- TATCACGCTGAGTGGAACCA -3’。 扩增片段为 309 bp。 用超纯水将上、下游引物分别配制成工作浓度为 10 ng/μL的溶液。 6.4.2 PCR反应体系 马铃薯干腐病菌 PCR扩增反应体系如表 1所示，按照以下顺序加入相应试剂到 PCR管中，混匀并离心 10 s，使混合液都沉降到 PCR管底。