ICS 65.020.01 CCS B 16 DB36 江 西 省 地 方 标 准 DB36/T 1744—2023 柑橘裂皮病和柑橘碎叶病 RT-PCR检测技术 规程 Technical specification for detecting Citrus exocortis and Citrus tatter leaf by RT-PCR 2023 - 02 - 10发布 2023 - 08 - 01实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 1744 —2023 I 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 样品采集 .......................................................................... 2 5 样品 RNA 制备 ...................................................................... 2 6 RNA 提取质量评价 ................................................................... 3 7 RT-PCR检测 ........................................................................ 3 8 电泳及成像分析 .................................................................... 5 9 结果判定 .......................................................................... 5 10 检测后样品的处理 ................................................................. 6 附录 A（资料性）柑橘裂皮病基本信息 .................................................... 7 附录 B（资料性）柑橘碎叶病基本信息 .................................................... 8 附录 C（规范性）主要仪器设备和试剂 .................................................... 9 附录 D（规范性）检测试剂和溶液配制 ................................................... 11 DB36/T 1744 —2023 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020给出的规则编写。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由赣州市市场监督管理局提出并归口。 本文件起草单位：赣南师范大学、国家脐橙工程技术研究中心、赣州市果业发展中心、江西省农业 农村产业发展服务中心。 本文件主要起草人：卢占军、陈红丽、黄爱军、胡珊玲、谢金招、余海中、钟八莲、姚锋先、苏华 楠、易龙、胡威、朱博、王希、曾芳群、陈奕芳、谢廉颉、陈慈相。 DB36/T 1744 —2023 1 柑橘裂皮病和柑橘碎叶病 RT-PCR检测技术规程 1 范围 本文件规定了柑橘裂皮病和柑橘碎叶病的术语和定义、 样品采集、 样品RNA制备、 RNA提取质量评价、 RT-PCR检测、电泳及成像分析、结果判定、检测后样品的处理。 本文件适用于柑橘类植物材料中疑似感染柑橘裂皮病或柑橘碎叶病的病原检测和病害鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注明日期的版本适用于本 文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 37874-2019 核酸提取纯化方法评价通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 柑橘裂皮病 Citrus exocortis disease 由柑橘裂皮病类病毒引起的柑橘病害，参见附录A。 3.2 柑橘碎叶病 Citrus tatter leaf disease 由柑橘碎叶病毒引起的柑橘病害，参见附录B。 3.3 柑橘裂皮病的病原 Citrus exocortis viroid (CEVd) 一种类病毒，没有蛋白质衣壳，是游离的低分子量核糖核酸（RNA），病原可通过嫁接、修剪工具 传播。 3.4 柑橘碎叶病的病原 Citrus tatter leaf virus（CTLV） 发状病毒属，病毒粒子为曲杆状，基因组是单链正义RNA分子，病原可通过嫁接、机械和菟丝子传 播。 3.5 DB36/T 1744 —2023 2 反转录-聚合酶链式反应 RT-PCR 经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 3.6 扩增引物 primer 人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标核酸序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。 3.7 扩增模板 template DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。 4 样品采集 4.1 取样物品 枝剪、剪刀等工具类，使用前后应（121 ±2）℃高压灭菌20 min；样品袋、刀片、手套等耗材类应 一次性使用，避免样品间相互污染。 4.2 取样方法 从树冠东、南、西、北四个方向各采集中部枝条1支，每支枝条至少带3片叶片，叶片为当年生， 新叶或成熟叶片，带叶片枝条装入密封袋中，标记并放入冰盒中保鲜处理，及时送交实验室检验。采集 的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过1周，若需长期保存，应置于-70℃以下保存。 5 样品 RNA 制备 5.1 检测样品均一化与切取 来自一棵采样树的所有枝条均应随机选取3-4个叶片， 用一次性无菌刀片切取叶片主脉两侧0.5cm～ 1.0 cm的侧脉组织，再切成长度0.1 cm以下的碎屑，越碎越好，混合所有来自叶片侧脉组织碎屑达100 mg 以上。 5.2 采用 TriZol 法制备样品RNA，操作步骤： 1) 取上述叶片侧脉组织碎屑，加液氮研磨成粉末状，迅速称取约 100 mg作为测试样品，装 入1.5 mL离心管， 加入 1000 μL的TriZol试剂， 振荡器上剧烈震荡 15 s， 冰上静置 15 min。 2) 将上述样品 4℃下，12000g离心5 min，吸取上清液约 500 μL，转移到新的 1.5 mL离心 管内，加入 200 μL氯仿-异戊醇溶液，振荡器上剧烈震荡 10 s后，放置于冰上 5 min。 3) 将上述样品 4℃下，12000g离心10 min，吸取上清液约 200 μL，转移到新的 1.5 mL离心 管内，加入等体积 4℃预冷的异丙醇溶液约 200 μL，上下轻柔颠倒离心管， -20℃下静置 1 小时。 DB36/T 1744 —2023 3 4) 将上述样品 4℃下，12000g离心10 min后，弃除上清液，冰上加入 4℃预冷的 75%乙醇 溶液1 mL，上下颠倒离心管洗涤沉淀， 4℃下12000g离心5 min收集半透明状沉淀，再 用75%乙醇溶液 1 mL重复洗涤 2次，最后 4℃下12000g离心5 min后收集沉淀，吸取离 心管内残余液。 5) 将上述样品放置于生物安全柜内通风干燥 5 min，加入适量 DEPC处理水溶解（约 20 μL- 60 μL），-20℃保存，作为后续 RT-PCR检测的待测样品模板。 6 RNA 提取质量评价 依据GB/T 37874-2019对提取的RNA样品进行质量评价。起始样品为100 mg叶片，提取到的总RNA产 量≥500 ng。纯RNA的OD 260/OD280为2.0，当RNA提取溶液的OD 260/OD280在1.7～2.0时表明RNA纯度基本可以满 足后续 RT-PCR检测需要。 所制备的RNA样本在4℃条件下保存应不超过7天，在-20℃冻存不超过30 天，避免反复冻融。 7 RT-PCR 检测 7.1 cDNA第一链合成体系 冰上操作按下表1加入DEPC处理水、dNTP、随机引物6N，RNA模板于PCR反应管中，混匀并低速离心， 转入PCR扩增仪中反应。PCR反应程序：65 ℃预变性 5 min。取出后立即冰水浴5 min。 表1 cDNA第一链合成体系 Ⅰ 检测试剂 终浓度 每管加入量 /µL 随