ICS11.220 CCSB41DB36 江西省地方标准 DB36/T1747—2023 新型鹅星状病毒病诊断技术规程 Diagnostictechnicalregulationsfornovelgooseastrovirusdisease 2023-02-10发布 2023-08-01实施 江西省市场监督管理局发布 DB36/T1747—2023 1I目  次 前 言.............................................................................II 1范围...............................................................................1 2规范性引用文件.....................................................................1 3术语和定义.........................................................................1 4临床诊断...........................................................................1 5实验室诊断.........................................................................2 6综合判定...........................................................................6 附录A（资料性附录）病毒分离所需仪器设备和试剂耗材...................................7 附录B（资料性附录）样品的采集、处理、运输及保存.....................................8 附录C（资料性附录）RT-PCR所需仪器设备和试剂耗材....................................9 附录D（资料性附录）荧光RT-PCR所需仪器设备和试剂耗材...............................10 附录E（资料性附录）RT-LAMP方法所需仪器设备和试剂耗材..............................11 附录F（资料性附录）新型鹅星状病毒RT-PCR引物、荧光RT-PCR的引物和探针、RT-LAMP引物12 参 考 文 献.......................................................................14 DB36/T1747—2023 II前 言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规定起草。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所。 本文件主要起草人：李海琴、张帆帆、康昭风、谭美芳、杨群、曾艳兵、韦启鹏、黄江南、方绍培、 谭佳、吴诚诚、季华员。 DB36/T1747—2023 11新型鹅星状病毒病诊断技术规程 1范围 本文件规定了新型鹅星状病毒病的术语定义、临床诊断、实验室诊断和综合判定技术要求。 本文件适用于新型鹅星状病毒病的诊断和流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用 文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 新型鹅星状病毒novelgooseastrovirus,NGoAstV 属于星状病毒科（Astroviridae）禽星状病毒属（Avastrovirus），星状病毒（Astroviruses,AstV）是 一种呈球形的RNA病毒，直径为25nm～35nm，病毒表面无囊膜，有5个～6个突起，用透射电子显微镜 观察呈五角星状或六角星状。 3.2 新型鹅星状病毒病novelgooseastrovirusdisease,NGoAstVD 指由新型鹅星状病毒引起的以雏鹅尿酸盐沉积在关节和（或）内脏为主要病理特征的传染病。。 3.3 鸡肝癌细胞系chickenhepatomacellline,LMH LMH细胞系是利用患肝细胞癌的鸡肝细胞致突变培育而成，是一种可以持续传代的鸡肝癌细胞系。 4临床诊断 4.1流行病学 病鹅、隐性带毒鹅、带毒种蛋是主要传染源，自然感染的潜伏期是3d，该病既可垂直传播、也可 DB36/T1747—2023 2水平传播。各品种鹅均易感，5日龄～20日龄雏鹅最易感，最早可在3日龄发病。死亡率30%～40%， 最高可超过50%。 4.2临床症状 患鹅精神沉郁，食欲减退，饮水量增加，消瘦，四肢瘫痪，排白色稀便，发病高峰期约在7日龄～ 14日龄。 4.3病理变化 4.3.1剖检病变 剖检病理变化主要表现为肾脏呈花斑肾，输尿管尿酸盐沉积，有的关节腔尿酸盐沉积严重，有的心 脏、肝脏表面有白色尿酸盐沉积。 4.3.2组织学病变 患鹅肾小管上皮细胞脱落坏死，管腔内充满粉红色的尿酸盐沉积，肾间质出血，肾小球肿胀；有的 心脏组织中心肌纤维排列紊乱、肿胀，有的肝脏可见少量炎性细胞或肝细胞空泡变性。 4.4临床诊断结果判定 符合4.1流行病学特征、病鹅出现4.2临床症状和4.3病理变化，可判定为新型鹅星状病毒病疑似病例， 应进行实验室确诊。 5实验室诊断 实验室生物安全要求按照GB19489执行。 5.1病毒分离 试验设备和试剂耗材准备见附录A，样品准备见附录B。 5.1.1细胞分离 5.1.1.1细胞的准备 细胞的准备工作包括以下内容： a)在37℃水浴中提前预热消化液（0.25%胰酶）和DMEM/F12细胞培养液，将生长良好的LMH 细胞用无菌PBS洗涤2次，弃去PBS； b)加入0.25%胰酶消化为单个细胞，加入细胞培养液，用吸管轻轻吹散细胞，再加入细胞培养液， 用吸管轻轻吹打使细胞分散均匀后，按每孔1mL加入到细胞培养瓶； c)在37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养24h～36h，密度达到80%时，用于细胞分离。 5.1.1.2病毒的分离培养 病毒的分离培养工作包括以下内容： a)将上述细胞培养液弃掉，用无菌PBS洗涤3次后，将处理好的样品接种到单层细胞上，每孔 0.2mL～0.4mL； DB36/T1747—2023 3b)放入细胞培养箱1h～2h，每隔15min轻轻摇动一次，吸附后弃掉液体，用无菌PBS洗涤3 次，加入细胞维持液，每孔1mL； c)于37℃含5%CO2的细胞培养箱中连续培养5d，每天观察细胞状态； d)待细胞液变黄，将细胞培养瓶反复冻融3次，细胞液经5000rpm离心10min后取上清用于检 测或置于-80℃保存。 5.1.2鹅胚分离 5.1.2.1种蛋准备 将种鹅蛋（新型鹅星状病毒阴性）置于孵化器中37℃下孵育10d～11d，用于病毒分离。 5.1.2.2鹅胚接种 将待检样品以0.2mL/胚的剂量经绒毛尿囊膜途径接种10日龄～11日龄鹅胚，37℃恒温培养箱中培 养，每天照蛋2次，连续观察6d，并记录死胚情况。 5.1.2.3尿囊液收集 弃掉接种后24h内死亡的鹅胚，若接种2d～6d内鹅胚出现死亡，则收集死亡鹅胚的尿囊液；若接 种6d内鹅胚不出现死亡，则收集6d活胚的尿囊液。 5.2病毒的鉴定 5.2.1RT-PCR技术 试验设备和试剂耗材准备见附录C。 5.2.1.1病毒RNA的提取 提取待检组织样品总RNA，提取的RNA立即用于反转录，否则置于-80℃冰箱冻存。 5.2.1.2病毒cDNA的合成 采用50μL体系，于无菌无酶EP管中依次加入RNA模板5μL、Buffer缓冲液10μL，随机引物2μL、 dNTPs(2.5mMeach)4μL、M-MLV反转录酶(200U/μL)1μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)2μL，补充无菌水 至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃45min、85℃2min、4℃5min 的程序进行一个循环，cDNA合成后进行PCR扩增或于-20℃保存备用。 5.2.1.3PCR反应体系及反应条件 配置PCR反应液，在样品制备区加样。采用25μL反应体系，见表1所示。 表1PCR反应体系 试剂 体积（μL） 2×PCRMix 12.5 上游引物（10μmol/L） 1.0 下游引物（10μmol/L） 1.0 模板cDNA 2.0 无RNA酶去离子水 8.5 总体积 25.0 DB36/T1747—2023 4瞬时离心，置PCR扩增仪内进行扩增，反应程序为95℃预变性3min；然后进入扩增循环：95℃30 s，55℃30s，72℃45s，35个循环；最后72℃延伸8min，4℃结束反应。 5.2.1.4PCR产物检测 将制备好的1.0%琼脂糖凝胶放入电泳槽（带加样孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TAE）浸过胶 面。DNAMarker、阴性对照产物、PCR产物和阳性对照产物各取7μL加入胶孔内，在110V电压下电泳 20min～40mi