ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36752—2018 藜草花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Sowbane mosaic virus 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36752—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共 和国厦门出人境检验检疫局、浙江大学。 本标准主要起草人：张永江、冯黎霞、向均、廖富荣、吴建祥、辛言言、李桂芬、陈青。 GB/T36752—2018 藜草花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了藜草花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。 本标准适用于可能带有藜草花叶病毒的植物种子、苗木及植物产品的检疫鉴定 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 藜草花叶病毒基本信息 3 学名：Sowbanemosaicvirus 缩写：SoMV 分类地位：南方菜豆花叶病毒属（Sobemouirus）成员 藜草花叶病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 Sad 藜草花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据SoMV与抗体之间的 特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）：依据SoMV的基因组特征 建立RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有SoMV。 5 5仪器用具与试剂 5.1仪器 电子天平（感量0.001g）。 高速冷冻离心机（最大转速15000r/min）。 小型瞬时离心机（最大转速7000r/min）。 普通冰箱（4℃）。 超低温冰箱（-80℃）。 制冰机（每日制冰能力为110kg）。 旋涡振荡器（最大转速为2800r/min）。 磁力搅拌器（搅拌容量50mL~2000mL）。 高压灭菌锅（最大压力为0.235MPa，可调控温度范围为105℃～135℃）。 pH计（量程pH0.00~14.00,精度±0.01pH)。 1 GB/T36752—2018 超净工作台（高效滤膜可除去99.99%以上的0.3μL粒子）。 PCR仪（温度范围4℃~99℃，控温精度士0.25℃）。 实时荧光PCR仪（温度范围4℃～99℃，控温精度士0.25℃）。 微波炉（烧烤型）。 电泳仪（输出电压5V~600V，输出电流2mA~200mA）。 凝胶成像分析仪（光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、 机载头像捕捉软件、图像分析软件）。 洗板机（清洗容量50L~2000μL）。 酶标仪（光源波长：250nm~750nm，温度范围4℃~99℃）。 5.2 用具 酶联板。 可调移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL） 可调移液器头。 1.5mL离心管。 研钵、微型磨杆等。 5.3 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 DAS-ELISA试剂见附录B。 RT-PCR检测试剂见附录C。 实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D。 6检测样品的制备 SZIG 6.1 种子样品 挑取畸形种子播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分 组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测。 也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。 6.2 苗木及植物产品 有症状的部分（如叶片畸形、花叶、斑驳等）单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植物产品， 按照SN/T2122中规定的抽样方法进行抽样，分组编号、分组方法和检测方法同6.1。 7检测鉴定 7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） 加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染SoMV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲 具体操作见附录B。 2 GB/T36752—2018 7.2 2RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总 RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C。如采用商品化一步法试剂盒，则按照 试剂盒说明进行。 7.3实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品 和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D。如采用商品化 步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 7.4斑点酶联免疫吸附测定（Dot-ELISA） 把制备的样品上清液点在硝酸纤维素膜上，进行Dot-ELISA检测，对照设置同7.1。具体操作见附 录E。 8结果判定 样品携带SoMV。 样品保存与结果记录 9 9.1样品保存 经检测确定携带SoMV的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在4℃，种苗、叶片 等样品保存在一80℃冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少1年。 9.2 2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶 荧光曲线图。 3