ICS 65.020.20 CCS B 21 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2594—2022 紫花苜蓿组织培养技术规程 Technical code of practice for tissue culture of medicago sativa 2022-06-24 发布 2022-07-24 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2594—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古农业大学。 本文件主要起草人：徐春波、王勇、赵海霞。 I DB15/T 2594—2022 紫花苜蓿组织培养技术规程 1 范围 本文件规定了紫花苜蓿组织培养的术语与定义、培养基、外植体、愈伤组织诱导培养、增殖培养、 分化培养、生根培养、炼苗与移栽等基本内容及技术要求。 本文件适用于紫花苜蓿组织培养育苗。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 NY/T 2306 花卉种苗组培快繁技术规程 DB15/T 1940 西部沙樱组织培养技术规 3 术语和定义 NY/T 2306界定的术语和定义适用于本文件。 紫花苜蓿 medicago sativa L. 属于豆科（Leguminosae）苜蓿属（Medicago）多年生草本植物。 4 环境与器具灭菌 按照DB15/T 1940操作。 5 培养基 基本培养基 MS培养基、1/2 MS、改良SH培养基和MSO培养基见附录A。 母液的配制和保存 5.2.1 配制 将常用试剂配制成50～100倍的母液，严格按照GB/T 603规定方法配制。所用激素均配制浓度为0.5 mg/mL，配制方法详见附录B。 1 DB15/T 2594—2022 5.2.2 保存 母液配制好分别贴上标签，注明溶液名称、配制倍数、配制日期、配制者。母液贮存在4 ℃的冰箱 中。贮藏时间在3个月之内，有霉菌和沉淀产生，则不准许使用。 培养基的配制 5.3.1 配制 配置1 L培养基时，先加蒸馏水600 ml～700 ml，再加入7.5 g琼脂，加热搅拌琼脂融化后加入25 g 蔗糖，搅拌溶解后再分别加入母液，搅拌均匀，加蒸馏水定容至1 L。 5.3.2 pH 值调节 用1 mol/L的NaOH将配制好的培养基调到pH值5.8～6.0，用酸度计或精密pH试纸测定。 5.3.3 分装和灭菌 配制好的培养基趁热分装。分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。切勿将培养基沾到瓶口和外壁上， 以免招致杂菌污染。分装后立即加盖，不同的处理做好标记。分装后进行灭菌，121 ℃状态下保持20 min。 6 外植体 无菌苗的培养 紫花苜蓿种子用75%的酒精灭菌3 min～5 min，无菌水冲洗，再用10%次氯酸钠消毒10 min～15 min， 无菌水冲洗5～6次后用灭菌的滤纸吸干种子表面的液体，接种到1/2 MS培养基上。 外植体的选择和制备 取7 d～10 d无菌苗的子叶和下胚轴或15 d～20 d无菌苗的叶片、叶柄和茎段，将外植体剪成3 mm～ 5 mm长的小块或小段。 7 愈伤组织诱导培养 培养基 诱导培养基为改良SH+2.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA。 接种 2 2 将外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，每2.5 cm ～3 cm 接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名 称和日期。 培养条件 白天25 ℃、晚上18 ℃，每天光照时间16 h，光照强度1000 Lux～2000 Lux。 培养时间 培养20 d～30 d。 2 DB15/T 2594—2022 8 增殖培养 培养基 增殖培养基1为MSO+0.5 mg/L NAA+ 1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L AgNO3。增殖培养基2为MS+0.3 mg/L TDZ。 接种 2 2 在超净工作台上，将诱导出的愈伤组织转到增殖培养基上，每4 cm ～5 cm 接种1个，均匀摆放，封 好皿口，标明名称和日期。 培养条件 按照7.3进行。 培养时间 增殖培养基1培养14 d～20 d，移到增殖培养基2继续培养5 d～7 d，之后再移至增殖培养基1培养 10 d～15 d。 9 分化培养 培养基 分化培养基为MS+0.2 mg/L KT。 接种 2 2 在超净工作台上，将胚性愈伤组织转入分化培养基，每5 cm ～6 cm 接种1个，均匀摆放，封好瓶口， 标明名称和日期。 培养条件 按照7.3进行。 培养时间 培养40 d～50 d；每20 d换1次培养基。 10 生根培养 培养基 生根培养基为1/2 MS。 接种 在超净工作台上，将长至3 cm～5 cm的小苗逐一转入生根培养基，每器皿接种1苗，封好瓶口，标 明名称和日期。 培养条件 3 DB15/T 2594—2022 按照7.3进行。 培养时间 培养20 d～30 d。 11 炼苗与移栽 炼苗 选择生长健壮的组培苗，打开封口膜，放在自然光、室温下2 d～3 d。 基质 土:草碳:蛭石3:2:1混合。高压灭菌后装入花盆备用。 移栽 取出组培苗，洗掉培养基，栽入花盆，浇水，放入温室，适当保温，常规管理。待苗长至20 cm～ 30 cm移栽至大田。 4 DB15/T 2594—2022 A A 附 录 A （规范性） 基本培养基成分 基本培养基成分见表A.1 。 表A.1 基本培养基成分 类型 组分 KNO3 NH4NO3 大量元素 微量元素 铁盐 有机物 MS 培养基 改良 SH 培养基 MSO 培养基 1900.0 2830.0 1900.0 463.0 1650.0 1650.0 MgSO4·7H2O 370.0 185.0 370.0 KH2PO4 170.0 400.0 170.0 CaCl2·2H2O 440.0 166.0 440.0 MnSO4·4H2O 22.300 ---- 22.300 ZnSO4·7H2O 8.600 8.600 8.600 H3BO3 6.200 ---- 6.200 KI 0.830 ---- 0.830 Na2MoO4·6H2O 0.250 0.250 0.250 CuSO4.5H2O4 0.025 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.025 Na2-EDTA 37.30 37.30 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 27.80 27.80 甘氨酸 2.000 ---- ---- 盐酸吡哆辛 0.500 9.500 1.000 盐酸硫铵素 0.100 9.900 10.000 烟酸 0.500 ---- 1.000 肌醇 100.000 ---- 100.000 ---- 4.500 ---- 尼克酸 5 DB15/T 2594—2022 B B 附 录 B （规范性） 激素的配制 激素的配制见表B.1 。 表B.1 激素的配制 类别 名称 配制方法 灭菌方式 存储方式 2，4-二氯苯氧乙酸 生长素 （2，4-D） 用适量无水乙醇溶解后加入去离 冷藏（4 ℃）， 高温灭菌 子水定容。 密封，避光保存 萘乙酸（NAA） 6-苄基嘌呤（6-BA） 用适量 0.1 M 的盐酸（HCL）溶 冷藏（4 ℃）， 高温灭菌 细胞分裂素 激动素（KT） 解后加入去离子水定容。 密封，避光保存 用适量二甲基亚砜（DMSO）溶解 噻苯隆（TDZ） 过滤灭菌 现配现用 过滤灭菌 现配现用 后加入去离子水定容。 硝酸银 6 硝酸银（AgNO3） 用去离子水溶解后定容。