ICS 65.020.30 CCS B40 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2555—2022 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技 术规程-乳汁分离法 Technical regulation of the isolation, primary culture and identification of Bovine Mammary Epithelial Cells derived from fresh milk 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2555—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。 本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、崔新洁、赵濛、云伏雨、张春华、羿静、 康长清。 I DB15/T 2555—2022 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法 1 范围 本文件规定了乳汁分离法培养鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞的术语与定义、材料、仪器和试剂耗材、 操作步骤等技术要求与规范。 本文件适用于从奶牛乳汁中分离培养和鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 原代奶牛乳腺上皮细胞 primary bovine mammary epithelial cells 从奶牛乳汁或乳腺中分离、培养并鉴定出来的上皮细胞。 免疫荧光技术 immunofluorescence technique 又称荧光抗体技术，是以荧光物质标记抗体，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的检测 和定位。 染色体组型分析 karyotype analysis 对不同生物的染色体组型（有丝分裂中期的染色体数目及其特征）进行定性和定量的分析和研究。 4 材料 乳汁来源 泌乳前期（22 d～100 d）健康奶牛。 取样 用无菌水及75 %酒精擦洗奶牛乳房，挤牛乳约500 mL分装于灭菌的蓝盖瓶中，37 ℃保温瓶保温带 回实验室。 1 DB15/T 2555—2022 5 仪器和试剂耗材 仪器 生物安全柜，CO2培养箱，高压蒸汽灭菌锅（137 ℃，0.25 MPa），普通光学显微镜，超低温冰箱 （-50 ℃～-86 ℃），PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，低速冷冻离心机（2000 g，-8 ℃～10 ℃），低 温高速台式离心机（20000 g，-8 ℃～10 ℃），酶标仪，恒温水浴锅，倒置荧光显微镜（40 x～640 x）。 试剂与耗材 5.2.1 试剂 PBS缓冲液，0.25 %胰蛋白酶，细胞冻存液，0.4 %台盼蓝，MTT(0.5 mg/mL)，二甲基亚砜(DMSO)， 总RNA提取试剂盒，DNA水解酶，反转录试剂盒，PCR试剂盒，Taq酶，琼脂糖，4 %多聚甲醛，山羊血清 （10 %），兔抗人角蛋白8多克隆抗体，FITC标记的山羊抗兔IgG ，DAPI（10 μg/ mL），秋水仙素（5 μg/mL），0.2 %TritonX－100，10 %Giemsa染色液等。 5.2.2 配制溶液组分 完全培养液：10 %FBS+DMEM/F12+100 U青链霉素双抗+氢化考的松（1 μg/mL）+孕酮（1 μg/mL） +转铁蛋白（5 μg/mL）+胰岛素（5 μg/mL）+谷氨酰胺（200 mmol/L）+EGF（10 ng/mL）。 核型分析固定液：甲醇：冰醋酸为3:1。 5.2.3 耗材 T25细胞培养瓶，96孔细胞培养板，90 mm培养皿，0.22 μM滤膜，15 mL/50 mL离心管，2 mL细胞 冻存管，无酶PCR管，移液器，血球计数板等。 6 操作步骤 分离培养 6.1.1 分离 6.1.1.1 在生物安全柜中，将 200 mL 乳汁与含青链霉素双抗（100 U/mL）的 PBS 按体积比 2：1 混合 后， 分装于 15 mL 无菌离心管中，500 g 离心 20 min，自上而下吸弃上层乳脂层及相邻乳白色浑浊层 的一半。 6.1.1.2 向剩余液体中加入等量含青链霉素双抗（100 U/mL）的 PBS，再次 500 g 离心 15 min，自上 而下缓缓吸弃大部分上清层，重复上述步骤，直至剩余 1 mL 左右。 6.1.1.3 将所有剩余液体收集于一个 15 mL 无菌离心管中， 等量 PBS 重悬，500 g 再次离心 5 min， 自上而下缓缓吸弃大部分上清层，重复上述步骤，直至剩余 1 mL 左右，即为乳汁中分离到的细胞层。 6.1.2 培养 向细胞层中加入5 mL完全培养液，接种于T25细胞培养瓶中，于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，每 隔48 h换液。待细胞形成单克隆后，原瓶胰酶消化，长至80 %汇集时，传代培养。 传代培养 2 DB15/T 2555—2022 待细胞长至80 %汇集时，吸弃培养液，用PBS清洗细胞两次；T25培养瓶加1 mL胰酶消化液，37 ℃ 消化10 min，普通光学倒置显微镜下观察到细胞变圆脱落后，加入至少200 μL胎牛血清终止消化，反 复吹打细胞，使细胞完全脱落，300 g离心5 min，弃上清，将收集的细胞按1:3的比例接种于新培养皿 中，于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，每隔48 h换液，待长至80 %汇集时，继续传代培养或将细胞冻存 备用。 冻存和复苏 6.3.1 冻存 上述方法消化细胞，用血清终止反应，用血球计数板计数后，300 g离心5 min，弃上清，根据细胞 6 数量计算冻存支数，沿管壁缓缓加入冻存液使细胞密度为2×10 /mL，用吸管轻轻吹打，令细胞处于重 悬状态。分装入无菌冻存管中，每瓶1 mL细胞悬液。标记冻存日期、细胞名称、培养代数等信息，放入 程序降温盒中，快速置于-80 ℃超低温冰箱中冻存，24 h后转入液氮罐中保存。 6.3.2 复苏 将冻存管从液氮罐中小心取出，迅速浸没在40 ℃温水的恒温水浴锅中解冻，解冻时间尽量控制在 1 min左右。用培养液重悬离心以清洗冻存液，保护细胞。用移液枪吸出细胞悬液，缓慢移入加有完全 培养液的细胞培养瓶中，于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，待长至80 %汇集时，可继续传代培养或冻存。 细胞生长曲线测定 采用MTT法，参考文献1。 角蛋白 8、18 和β-酪蛋白测定 6.5.1 引物设计 根据NCBI上公布的牛基因序列设计引物，引物序列符合附录A。 6.5.2 RT-PCR 复苏培养，生长到80 %汇集时，用胰酶消化并收集细胞，用总RNA提取试剂盒抽提细胞总RNA。为排 除基因组DNA的污染，用DNA酶消化处理后，用反转录试剂盒反转录，用PCR反应试剂盒进行扩增反应并 电泳检测扩增产物。PCR扩增反应条件均为95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；62 ℃，30 s；72 ℃，30 s； 72 ℃，10 min；30个循环。扩增体系符合附录B。 细胞免疫荧光染色法鉴定角蛋白 8 6.6.1 固定 细胞复苏培养，生长到80 %汇集时，吸弃培养液并用PBS清洗细胞2～3次，常温下多聚甲醛固定30 min，用PBS清洗细胞3次，每次5 min～10 min。 6.6.2 封闭 TritonX－100处理5 min，用PBS清洗细胞3次，每次5 min～10 min；山羊血清封闭30 min。 6.6.3 抗体处理 3 DB15/T 2555—2022 加一抗（兔抗人的细胞角蛋白8多克隆抗体100倍稀释，空白对照试验用PBS代替）于37 ℃下振荡孵 育1 h或4 ℃过夜孵育，用PBS清洗细胞3次，每次5 min～10 min；加入二抗（50倍稀释的FITC标记的山 羊抗兔的IgG）并于室温下避光振荡孵育30 min，用PBS清洗细胞3次，每次5 min～10 min。 6.6.4 鉴定 加入DAPI染色液于室温避光孵育10 min，荧光显微镜下观察结果。正常奶牛乳腺上皮细胞会呈强阳 性，发出绿色荧光，核为蓝色荧光；空白对照组的细胞检测呈阴性。参照图见附录C。 染色体中期分裂相制备与组型分析 6.7.1 细胞复苏培养与消化 复苏步骤同6.3.2，生长到80 %汇集时，向培养液中加入秋水仙素使其终浓度为0.1 μg/ mL，在 37 ℃、5 % CO2培养箱中继续培养3 h～4 h；消化步骤同6.2。 6.7.2 分裂相制备 缓缓加入5 mL 低渗KCl（0.075 M，37 ℃预热），并轻吹细胞使其悬浮，37 ℃孵育30 min，加入 1 mL新鲜配制的核型分析固定液预固定3 min，300 g离心5 min，弃上清，加入新鲜配制的核型分析固 定液6 mL，并轻吹细胞使其悬浮，室温孵育30 min，重复固定细胞2次并离心后，小心吸除大部分上清 液，余下0.5 mL固定液，轻吹细胞使其悬浮。 6.7.3 制片染色 用滴管吸取少量细胞悬液，从1 m高处滴落在洁净载玻片上（-20 ℃预冷），迅速于酒精灯上过火 烤干，将制作的标本浸入Giemsa染色液浸染10 min，流水冲洗至水流无色并自然风干。 6.7.4 观察照相 染色体标本首先用低倍镜检查，当寻找到分散良好、轮廓清晰的分裂相后，换用高倍镜和油镜观察 拍照。 6.7.5 组型分析 拍照后进行染色体组型的排列分析。染色体数目应为60，2 n=60；核型为60，XX。其中29对常染色 体为端着丝粒染色体，一对性染色体是近端着丝粒染色体。参照图见附录C。 4 DB15/T 2555—2022 A A 附 录 A （规范性） PCR 扩增反应引物 牛基因序列设计引物见表A.1。 表A.1 PCR 扩增反应引物 Gene Bank 序列号 基因 NM_001033610.1 角蛋白 8 引物序列(5’- 3’) 产物长度 F: TGGAAGGGCTGACTGATGAG 540 bp R: GCTTCCTGTAGGTGGCAATC F: CAGGGCGAGAAGGAGACCAT NM_001192095.1 角蛋白 18 504 bp R: TAAGGTCCTGAGGTTTGGGG F: ATCCCTAACAGCCTCCCAC NM_181008.2 β-酪蛋白 303 bp R: AGAAAGGGACAGCACGGAC 5 DB15/T 2555—2022 B B 附 录 B （规范性） PCR 扩增反应体系 PCR扩增反应体系见表B.1。 表B.1 PCR 扩增反