ICS07.100.99 CCSB41T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ099—2021 畜禽源细菌耐药性测定纸片扩散法 Methodfordrugresistancesurveillanceofzoonoticbacteria -Diskdiffusionmethod 2021-12-24发布 2022-01-24实施 浙江省农产品质量安全学会发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ099—2021 I前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院、浙江大学。 本文件主要起草人：周炜，周芷锦，杨华，赵灵燕，陈洁，陈勇，沈红霞，姜中其，倪柏锋，唐标， 吉小凤，穆琳，陈凯。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ099—2021 1畜禽源细菌耐药性测定纸片扩散法 1范围 本文件规定了纸片扩散法检测畜禽源细菌耐药性的方法。 本文件适用于从畜禽及其产品中分离的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌耐药性 的纸片扩散法检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细菌耐药性antibacterialresistance 细菌对抗菌药物不敏感的现象。 3.2 药敏试验antibacterialsusceptibilitytesting 测定微生物（本文件特指细菌）在体外对抗微生物药物（本文件特指抗菌药物）敏感性，以指导临 床合理选用药物的微生物学试验。 3.3 折点breakpoint 用于判定测试菌株敏感（Susceptible，S）、中介（Intermediate，I）和耐药（Resistant，R）的最低 抑菌浓度。 注：最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，MIC)指体外能够抑制肉眼可见的细菌生长的最低药物浓度。 3.4 纸片扩散法diskdiffusionmethod 将含抗菌药物的纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板上，根据培养后出现在纸片周围的抑菌圈直 径，判定细菌对药物敏感性的定性方法。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ099—2021 24设备和材料 4.1实验室 应符合GB19489生物安全二级实验室（BSL-2）要求。 4.2仪器设备 需要用到的相关仪器设备如下： a)恒温培养箱：精度±1℃。 b)高压灭菌器。 c)普通冰箱：0℃～8℃，-18℃以下。 d)超低温冰箱。 e)天平：感量0.1g。 f)游标卡尺：精度0.1mm。 g)药敏纸片分配器或镊子。 h)半自动或自动抑菌圈测量仪（选购）。 i)商品化McFlarland标准比浊管或比浊仪。 j)灭菌棉拭子。 k)pH计或pH试纸。 4.2培养基与试剂 根据检测目标菌株选购： a)商品化运输培养基：半固体、液体均可。 b)Mueller-Hinton琼脂（MHA）：见附录A中A.1。 c)胰酪胨大豆肉汤（TSB）：见A.2。 d)胰酪胨大豆琼脂（TSA）：见A.3。 e)缓冲蛋白胨水：见A.4。 f)7.5％氯化钠肉汤：见A.5。 g)10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见A.6。 4.3质控菌株 根据检测目标菌株选择： a)大肠埃希氏菌和沙门氏菌质控菌株：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）/ATCC25922； b)肠球菌和金黄色葡萄球菌质控菌株：金黄色葡萄球菌（Staphyfococcusaureus）/ATCC25923。 质控菌株复苏后，分装并于-70℃以下保存，用前复苏。如需传代保存，传代不应超过5代。 4.4商品化抗菌药物纸片 根据检测目标菌株与药物选购，药物含量应至少包括本标准规定的浓度（附录C）。 5试样的采集与制备 5.1畜禽肛拭子 全国团体标准信息平台 T/ZNZ099—2021 3取经运输培养基浸润的灭菌棉拭子，插入家畜肛门或家禽泄殖腔1.5cm～2.0cm，轻轻旋转2圈～ 3圈后，迅速放入10mL缓冲蛋白胨水运输培养基或商品化运输培养基中，加盖密封，0℃～4℃保存。 如试料暂存、运输时间不超过72h，则也可用灭菌生理盐水作为运输培养基。细菌的培养、分离与鉴定 直接使用运输培养基中的采样拭子。 5.2畜禽产品 迅速无菌采集目标畜禽产品约25g，放入无菌容器中，0℃～4℃保存。试样中加入225mL缓冲 蛋白胨水，使分散均匀后，用于细菌的培养、分离与鉴定。 5.3病料 无菌采集新鲜病料约5g，放入无菌容器中，0℃～4℃保存。试样中加入TSA培养基25mL～50mL， 使分散均匀后，用于细菌的培养、分离与鉴定。 5.4生鲜乳 生鲜乳仅适用于金黄色葡萄球菌的耐药性检测。取未经消毒处理的生鲜乳10mL，置灭菌试管中， 0℃～4℃保存，不超过48h。取生鲜乳试样1mL至盛有10mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨 大豆肉汤中，振荡混匀。用于细菌的培养、分离与鉴定。 6测定方法 6.1细菌的培养和分离 大肠埃希氏菌按附录B.1执行；沙门氏菌按附录B.2执行；肠球菌按附录B.3执行；金黄色葡萄球 菌按附录B.4执行。若24h内不能进行耐药性测定，培养皿应置0℃～4℃冰箱暂存。也可挑取典型的 单一菌落，冷冻暂存，耐药性测定前复苏。 6.2标准抗菌药物纸片的准备 6.2.1抗菌药物纸片的保存和使用 商品化的抗菌药物纸片的使用和保存的方法参见其产品说明书。临用前将抗菌药物纸片从冰箱中取 出置室温平衡，并避免产生冷凝水。 6.2.2抗菌药物纸片的质量控制 抗菌药物纸片的质量控制按附录C中C.4执行。 6.3细菌耐药性的测定 6.3.1接种物制备 挑取纯化用营养琼脂平板上的典型目标菌落，悬浮于5mLTSB或无菌生理盐水中，用McFarland 标准比浊管或比浊仪校正至0.5麦氏单位，细菌浓度相当于1.5×108CFU/mL。制备好的菌液应在15min 内使用。 6.3.2接种平板 6.3.2.1方法一：以无菌拭子蘸取菌液，在管壁内轻轻旋转挤压，去掉多余菌液。用拭子均匀涂抹MHA 表面，重复两次，每次旋转平板约60°，确保接种液均匀涂布。最后在琼脂平板边缘涂抹一圈。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ099—2021 46.3.2.2方法二：在MHA表面滴加300µL菌液，用无菌的涂布棒均匀涂布。室温放置3min～5min， 待平板上的水分被琼脂完全吸收。 6.3.3贴药敏纸片 用无菌镊子或药敏纸片分配器按需要逐片贴上标准抗菌药物纸片，轻压使其紧贴在琼脂表面，纸片 一旦接触平板就不可再移动。各纸片中心相距应该大于24mm，纸片距离平板内缘应大于15mm。直 径90mm的平板放置不超过5个纸片（参见图1）。 图1药敏纸片贴置示意图 6.3.4细菌培养 贴完纸片后的15min内翻转琼脂平板，于36℃±1℃培养17h±lh。培养过程中平板宜单独摆放， 叠放时不超过2个。 6.3.5抑菌圈判读 取出平板，在透射光下用游标卡尺在平板的背面量取各纸片的抑菌圈直径（包括纸片的直径），抑 菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。在抑菌圈边缘的只能在放大镜下观察到的微小菌落的生长 可忽略不计。也可使用半自动或自动抑菌圈测量仪读取数据。 6.3.6质量控制 每次进行细菌耐药性测定时，应同步设置质控菌株对照，操作同6.3.1～6.3.4。测量质控菌株的抑 菌圈，其直径在附录C规定限度范围之内，试验方成立。 6.4结果及判断 将各抗菌药物纸片的抑菌圈直径与耐药折点判断标准（按附录C）进行比较，报告被测细菌对该抗 菌药物敏感（S）或中介（I）或耐药（R）。 7生物安全 7.1样品采集 畜禽源细菌耐药性的样品采集需严格按照《中华人民共和国生物安全法》、《病原微生物实验室生 物安全管理条例》及相关法律法规的要求，未经兽医主管部门许可，不得对可疑或确诊的一类或二类病 原生物感染的动物个体/群体进行采样。 7.2检测过程 全国团体标准信息平台 T/ZNZ099—2021 5畜禽源细菌耐药性的检测过程，应在《兽医实验室生物安全技术管理规范》中规定的生物安全二级 实验室条件下进行。试验过程产生废弃物的处置应严格按照GB19489规定执行。菌株管理按照《动物 病原微生物菌（毒）种保藏管理办法》执行。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ099—2021 6附录A （规范性） 培养基 A.1Mueller-Hinton琼脂（MHA） A.1.1配方 牛肉浸膏粉 5.0g 干酪素水解物 17.5g 水溶性淀粉 1.5g 琼脂 13.0g～15.0g 蒸馏水 1000mL A.1.2制备 除琼脂外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解冷却后，调pH至7.3±0.1，再加入琼脂，加热煮 沸，使琼脂溶化，分装，121℃高压灭菌15min。灭菌完成后，倾注平板，使厚度为4mm±1mm（一 般直径90mm的平皿倾注约20mL）。该平皿可于2℃～8℃条件下保存7d。接种时，平板表面应湿 润，但平皿盖和琼脂表面不能有液滴。 A.2胰酪胨大豆肉汤（TSB） A.2.1配方 胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）17.0g 植物蛋白胨 3.0g 氯化钠 5.0g 磷酸二氢钾 2.5g 葡萄糖 2.5g 蒸馏水 1000