ICS07.080 CCSA40 中华人民共和国国家标准 GB/T47145—2026 重组蛋白试剂 亲和力测定方法 Recombinantproteinreagents—Determinationmethodofaffinity 2026-01-28发布 2026-05-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本文件起草单位:中国计量大学、华大工程生物学长荡湖研究所、北京百普赛斯生物科技股份有限 公司、中国测试技术研究院、中国食品药品检定研究院、上海市计量测试技术研究院有限公司、浙江康佰 裕生物科技有限公司、江苏百英生物科技有限公司、中国食品发酵工业研究院有限公司、常州新一产生 命科技有限公司、杭州华大赛迪斯逆熵科技有限责任公司、北京华放天实生物制药有限责任公司、北京 泰德制药股份有限公司、北京索莱宝科技有限公司、国健药业(深圳)集团有限公司、云南师范大学、中国 计量测试学会、中国测试技术研究院生物研究所。 本文件主要起草人:张雅芬、王媚娘、陈宜顶、叶子弘、周李华、苗景赟、李俊芳、郭世富、李兰英、 杨文君、项鲁、高波、葛平菊、石晓娟、姜万龙、费琦、郑越、熊思驰、刘茜、朱艳泽、王然、吴骏成、陈怡晨、 杨芸芸、孙丽芹、孔雪、李维、马玉岭、戴继海、李富昌、杨扬仲夫、王彧婕、刘和春。 ⅠGB/T47145—2026重组蛋白试剂 亲和力测定方法 1 范围 本文件描述了重组蛋白试剂亲和力的酶联免疫吸附测定方法。 本文件适用于细胞因子、抗体和抗原等重组蛋白试剂的亲和力测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T40265 酶免疫检测抗体检测通则 3 术语和定义、缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 重组蛋白试剂 recombinantproteinreagent 通过重组DNA等技术在宿主表达系统中表达的蛋白质经纯化后制备的试剂。 注:重组蛋白试剂,如细胞因子、抗体和抗原等,广泛用于科研、诊断或工业用途。宿主表达系统包括大肠杆菌、酵 母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其他细胞。 3.1.2 亲和力 affinity 在特定条件下,重组蛋白与其靶标之间单一结合位点的相互作用强度。 注:亲和力通常以平衡解离常数(KD)表示,单位为摩尔每升(mol/L)。 3.1.3 靶标 target 在特定条件下,能被重组蛋白特异性识别并结合的分子。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA:牛血清白蛋白(bovineserumalbumin) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) ELISA:酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay) KD:平衡解离常数(equilibriumdissociationconstant) OPD:邻苯二胺二盐酸盐(o-phenylenediaminedihydrochloride) 1GB/T47145—2026PBS:磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsaline) RP-HPLC:反相高效液相色谱法(reversed-phasehigh-performanceliquidchromatography) SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis) SPR:表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance) TMB:3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) 4 一般要求 4.1 除非另有说明,测试中试剂均为分析纯以上,水应符合GB/T6682的规定。 4.2 试剂应根据说明书要求保存及配制,测定前应根据试剂说明书或产品质量报告验证试剂质量,以 避免试剂性能改变影响试验结果。 4.3 应采用标准品/参考品或文献等资料记载具有量值的样品作为阳性样品。检测时应包含阴性对照 (无结合活性的蛋白)。 4.4 含蛋白的样品及废液处理应符合GB19489的规定。 5 原理 酶联免疫吸附法通过将靶标固定于固相载体表面,与待测样品在溶液中结合形成免疫复合物,并用 酶标抗体进行检测。通过测定不同浓度样品平衡结合下的吸光度值,绘制结合曲线,采用非线性回归法 拟合计算得到平衡解离常数(KD)来表示亲和力大小。 6 试剂与材料 6.1 靶标 根据应用需求选择待测样品的靶标,需经过理化分析(SDS-PAGE或RP-HPLC)和活性验证 (ELISA或SPR),确保其纯度及结合活性。 6.2 包被液 根据待包被靶标特性选择适宜的包被液。 注:包被液如pH为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液。 6.3 稀释液 根据待测样品特性选择适宜pH的PBS或其他等效缓冲溶液,可加入少量蛋白和少量表面活性剂 以保护待测样品中目标物的活性并减少背景干扰。 注:蛋白如0.01g/mL的BSA;表面活性剂如体积分数为0.05%的吐温-20(Tween-20)。 6.4 洗涤缓冲液 选择含有适量表面活性剂的PBS或其他等效缓冲溶液。 注:表面活性剂如体积分数为0.05%的吐温-20(Tween-20)。 6.5 封闭液 选择含有较高浓度蛋白的PBS或其他等效缓冲溶液。 2GB/T47145—2026注:较高浓度蛋白如0.02g/mL~0.05g/mL的BSA。 6.6 显色工作液 根据不同的显色系统以及不同指标(动态范围、动力学速率和检测时间等)选择适宜的显色底物,配 制或购买相应的显色工作液。 注:显色底物如TMB和OPD。 6.7 终止液 根据测定范围的需求选择合适的终止液。 注:终止液如1mol/L硫酸。 6.8 酶标抗体 酶标抗体应按GB/T40265的规定进行检测,应选择与所检测样品种属来源相匹配的特异性抗体, 并通过预实验确定最佳稀释倍数。 7 仪器与设备 7.1 天平:分度值为0.01g、0.001g和0.0001g。 7.2 pH计:0.01级。 7.3 恒温孵育器:温度范围应覆盖37℃,控温最大允许误差±1℃。 7.4 微孔板自动洗板机:具备自动化清洗功能。 7.5 酶标板:选择高结合力的ELISA板(96孔或其他规格),根据实验需要进行涂层。 7.6 酶标仪:具备吸光度、化学发光或荧光强度等光学信号的检测功能。 7.7 各种规格的离心管。 7.8 各种规格的微量移液器。 7.9 数据处理软件:如GraphPadPrism。 8 测定步骤 8.1 靶标包被 8.1.1 包被固定靶标 用适量包被液稀释靶标至合适浓度(通常为1μg/mL~10μg/mL,可经8.2验证),以每孔100μL 的量将稀释好的靶标溶液加至酶标板中,37℃恒温孵育2h~3h或者4℃恒温孵育12h~16h(可经 8.2验证)。 8.1.2 清洗 弃去酶标板中的液体,使用微孔板自动洗板机对酶标板进行清洗,清洗过程重复3次~5次。清洗 结束后,将酶标板倒置于吸水纸上轻拍,确保孔内无残留液体。 8.1.3 封闭 加入足量的封闭液至酶标板中,37℃恒温孵育1.0h~1.5h。 3GB/T47145—20268.1.4 清洗 重复步骤8.1.2。 8.2 包被的靶标浓度和时间验证(可选) 将梯度稀释的待测样品溶液以每孔100μL的量分别加至不同浓度靶标的包被板中,按8.4和8.5 进行亲和力测定和结果分析,计算信噪比(阳性孔均值与阴性孔均值的比值)和变异系数。若信噪比大 于或等于10,变异系数小于或等于10%,则说明该包被的靶标浓度符合要求。必要时,绘制“包被浓度- 吸光度值”曲线,优先选择进入平台期(两个包被浓度的吸光度值变化率小于或等于5%)的最低浓度作 为推荐包被浓度。 注1:不同包被浓度如1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL等。 采用相同包被浓度,设置4℃或37℃两个温度条件下的梯度时间进行孵育,按8.1完成靶标包被, 按8.4和8.5进行亲和力测定和结果分析,计算信噪比(阳性孔均值与阴性孔均值的比值)和变异系数。 若信噪比大于或等于10,变异系数小于或等于10%,则说明该孵育时间符合要求。必要时,绘制“包被 时间-吸光度值”曲线,优先选择进入平台期(两个包被时间的吸光度值变化率小于或等于5%)的最短 时间作为推进孵育时间。 注2:4℃温度条件下的梯度时间如12h、18h、24h等;37℃温度条件下的梯度时间如1h、2h、3h等。 8.3 待测样品准备 需明确待测样品中含有的重组蛋白的质量或浓度。 固体样品:取适量样品用稀释液溶解配制母液。 液体样品:取适量待测样品用稀释液稀释配制母液。 根据需要将母液用稀释液以2倍~5倍进行梯度稀释,获得系列梯度浓度待测样品溶液,记录其中 重组蛋白的物质的量浓度,宜稀释8个~10个浓度备用。 8.4 亲和力测定 8.4.1 加样 将梯度稀释的待测样本各取100μL加至按8.1制备的靶标包被板中,每个稀释度