ICS _65. 160 YC X 87 备案号：25965—2009 中华人民共和国烟草行业标准 YC/T282—2009 烟叶 游离氨基酸的测定 氨基酸分析仪法 Tobacco leaf-Determination of dissociated amino acids- Amino acids analyzer method 2009-03-30发布 2009-05-01实施 国家烟草专卖局 发布 YC/T282—2009 前言 本标准的附录A、附录B、附录C为资料性附录。 本标准由国家烟草专卖局提出。 本标准由全国烟草标准化技术委员会卷烟分技术委员会（SAC/TC144/SC1)归口。 本标准起草单位：湖北中烟工业有限责任公司、中国烟草总公司郑州烟草研究院。 本标准主要起草人：王娟、李丹、刘建锋、马舒翼、宋旭艳、郭国宁、刘克建 I YC/T282—2009 烟叶游离氨基酸的测定 氨基酸分析仪法 1范围 本标准规定了烟叶中游离氨基酸的氨基酸分析仪测定方法。 本标准适用于烟叶中天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu） 脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪 氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、β丙氨酸（β-Ala）、β氨基异丁酸（βAia）、-氨基丁酸（-Aba）、赖氨酸 （Lys）、组氨酸（His）、色氨酸（Trp）、精氨酸（Arg）等21种游离氨基酸的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 YC/T31一1996烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 烟叶中游离氨基酸dissociatedaminoacid(freeaminoacid)intobaccoleaf 烟叶的盐酸浸出物中，以游离状态存在、未结合在蛋白质分子中的氨基酸， 4原理 氨基酸为两性电解质，在酸性环境下形成阳离子。烟叶中的游离氨基酸经酸溶液萃取后，经氨基酸 分析仪的磺酸型锂离子交换柱分离，然后与三酮混合，通过加热反应，伯胺与之生成蓝紫色化合物，仲 胺与之生成黄色化合物。两种衍生物使用波长分别为570nm和440nm的双通道紫外检测器同时进行 定性定量分析测定（氨基酸分析仪管路图参见附录A）。 5试剂 除特别要求以外，本标准所使用的试剂均为分析纯试剂，水为去离子水， 5.1盐酸溶液，0.005mol/L 准确移取420μL浓盐酸（质量分数为36%38%）于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。此溶 液作为萃取溶液。 5.2样品稀释液，pH2.20。 准确称取四水柠檬酸三锂11.3g，柠檬酸6.0g，溶于500mL水中，然后加人20mL25%（质量分 数）硫二甘醇溶液和15mL32%（质量分数）盐酸溶液。转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 5.3锂离子缓冲溶液1) 1）锂离子缓冲溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据所使用仪器的情况自行调整。 1 YC/T282—2009 5.3.1缓冲液A.pH2.95。 准确称取四水柠檬酸三锂11.3g，柠檬酸6.0g，溶于500mL水中，然后加人50mL甲醇溶液和 9mL32%（质量分数）盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 5.3.2缓冲液B.PH4.20。 数)盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 5.3.3缓冲液C.pH3.50。 准确称取四水柠檬酸三锂18.8g，氯化锂50.9g，溶于500mL水中，然后加人10mL32%（质量分 数)盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 5.4钾钠缓冲液，pH5.51。 准确称取三水乙酸钠272.0g，乙酸钾196.0g，溶于200mL乙酸［99%~100%（质量分数）中，转 移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 5.5三酮溶液2) 准确称取三酮20.0g，苯酚2.0g，溶于600mL甲醇中，转移至1000mL容量瓶中，用钾钠缓冲 液（5.4)定容至刻度。此溶液应现配现用。 5.6还原剂 每1000mL三酮溶液（5.5)中加入0.2g抗坏血酸 5.7混合氨基酸标准储备液 本标准中所规定的21种氨基酸的浓度均为1.0μmol/mL。 5.8混合氨基酸标准工作溶液3 分别移取一定量的混合氨基酸标准储备液（5.7），用样品稀释液（5.2）配制成各氨基酸浓度均为 5nmol/mL、20nmol/mL、50nmol/mL、100nmol/mL、200nmol/mL的系列混合氨基酸标准工作溶液 该标准工作溶液在4℃冰箱内可保存3个月。 6仪器 常用实验仪器以及下述各项。 6.1旋风式样品磨：60目筛网。 6.2分析天平：感量0.0001g。 6.3移液器：移液范围为50μL~200μL和200μL~1000μL。 6.4 超声波振荡器：功率≥60W。 6.5 氨基酸分析仪（锂离子系统）：同时具有自动进样，梯度洗脱，以及双通道紫外检测的功能。 6.6高速离心机。 6.7水相滤膜，0.45μm。 7分析步骤 7.1试样的制备 按照YC/T31一1996中6.1的要求处理烟叶样品后，通过60目筛过滤制备试样，并按照 YC/T31一1996中6.2的要求测定试样的水分含量。 7.2测定次数 2）节三酮溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据使用仪器的情况自行调整。 3）系列混合氨基酸标准工作液的浓度范围为推荐性的，操作者可根据操作习惯和所用仪器的灵敏度特点自行调 整，要求至少制备5个工作标准溶液，且样品的浓度应在仪器的线性工作范围之内。 2 YC/T282—2009 每个样品应平行测定两次。 7.3样品分析 7.3.1样品制备 称取约1g试样（7.1)于100mL磨口三角瓶中，精确至0.0001g。准确加人盐酸溶液（5.1)50mL， 塞上塞子，室温下超声萃取30min。经离心后，取上清液，使用水相滤膜（6.7）过滤后上机分析。 7.3.2氨基酸分析仪分析 7.3.2. 1 按照仪器说明书操作氨基酸分析仪。以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适 用性。 流动相A：缓冲液A（5.3.1）； 流动相B：缓冲液B(5.3.2)； 流动相C缓冲液C(5.3.3）； 分离柱初始温度：37℃； 反应管温度：130℃； 流动相流速：0.45mL/min； 节三酮溶液流速：0.25mL/min； 进样体积：100=L； 检测器：双通道紫外检测器，570nm和440nm。 7.3.2.2 仪器梯度洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 t/min 流动相A/% 流动相B/% 流动相C/% 0 100 0 0 11 100 0 0 12 79 21 0 34 79 21 0 46 42 89 0 61 20 80 64 0 100 0 69 0 100 122 0 0 100 7.3.3 样品测定 用氨基酸分析仪测定系列混合氨基酸标准工作溶液（5.8），得到21种氨基酸的积分峰面积，用峰面 积为纵坐标，氨基酸浓度（ug/mL)为横坐标分别建立21种氨基酸的标准工作曲线，相关系数应不小于 0.9995。测定烟叶萃取样品，根据样品中氨基酸的峰面积计算21种氨基酸的浓度。混合氨基酸标准 溶液和烟叶样品的参考色谱图参见附录B。 结果计算 8 按式（1)计算烟叶中21种游离氨基酸的含量。 cxVxk = .(1 ) mx(l-w) 式中： 样品中氨基酸的含量，单位为微克每毫克（ug/mg）； 3