SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2154—2008 进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌 检测方法 兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术 Determination of coagulase-positive sta phylococci in import and export food- Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium 2008-09-04发布 2009-03-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 豆丁网：国内外标准大全 http://www.docin.com/kmust 1. SN/T 2154—2008 前 言 方法第2部分：免血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术》［Microbiologyoffoodandanimalfeeding stuffsHorizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (staphylococcus aureus andspecies)—Part2：TechniqueusingrabbitplasmafibrinogenagarmediumJ,MPN法参照了 ISO6888-3《食品和动物饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的检测方法第3部分：MPN检测技术》[Micro biology of food and animal feeding stuffsHorizontal method for the enumeration of coagulase-posi- tive staphylococci (staphylococcus aureus and species)-Part 3:Detection and MPN technique for low numbers]。 本标准的附录A和附录B均为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山西出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：赵贵明、刘沛、李卫华 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 I 豆丁网：国内外标准大全 http://www.docin.com/kmust1 SN/T2154—2008 进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌 检测方法 兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术 1范围 本标准规定了进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌的检测方法， 本标准中直接平板计数法适用于食品中凝固酶阳性葡萄球菌的计数，MPN法适用于凝固酶阳性 葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品。动物饲料等其他食品可参照执行。 设备和材料 2.1灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅和干热灭菌箱。 2.2水浴箱：48℃±1℃。 2.3培养箱：36℃±1℃。 2.4吸管：1mL和10mL，分刻度分别为0.01mL和0.1mL。 2.5接种环：3mm直径。 2.6 天平：量程2kg，灵敏度0.1g。 2.7 灭菌样品处理器具：取样勺，剪刀，开罐器等。 2.8 样品稀释瓶：250mL、500mL。 2. 9 无菌培养皿：直径90mm。 2.10 均质器。 2. 11 无菌试管。 2. 12 酒精灯或煤气灯。 2. 13 pH计。 2. 14 金黄色葡萄球菌（凝固酶阳性）标准质控菌株：ATCC27217或其他来源的经验证合格的菌株。 3 培养基和试剂 3.1 兔血浆纤维蛋白原（RPF)琼脂培养基（见附录A第A.1章）。 3.2改良GC肉汤（modifiedGiolittiandCantonibroth，见附录A第A.2章）。 3.3 水琼脂（见附录A第A.3章）。 3.4 蛋白陈氯化钠溶液（见附录A第A.4章）。 第一法直接平板计数法 4检验程序 检验程序见图1。 豆丁网：国内外标准大全 http://www.docin.com/kmust1 SN/T2154—2008 检样 25g(mL)样品+225mL蛋白陈氯化钠溶液，均质 10倍系列稀释 选择3个连续的适宜浓度的样品匀液， 各取1mL分别加入无菌培养皿内 每皿中加入15mL~20ml RPF琼脂培养基，混匀 36℃±1℃ 24 h~48 h 计数各平板菌落数 报告 图1凝固酶阳性葡萄球菌直接平板计数法检验程序 5操作步骤 5.1样品的制备 5.1.1样品的整个制备过程均应遵循无菌操作程序 5.1.2冷冻样品检验前可在0℃～4℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件 解冻，时间不超过15min。 5.1.3液体样品应先将其充分摇匀。 5.2样品匀液的制备 杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1：10样品匀液；或于装有225mL蛋白 陈氯化钠溶液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1：10的样品匀液。 5.2.2液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL放人装有225mL蛋白陈氯化钠溶液的无菌玻璃瓶（瓶 内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1：10的样品勾液。 5.2.3用10mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品勾液10mL，沿管壁缓慢注于装有90mL稀 释液的无菌三角瓶中，振摇均匀或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。 如需进一步稀释，按上述顺序操作。 5.3接种及培养 5.3.1根据对样品污染情况的估计，选择3个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在 做10倍递增稀释的同时，吸取1mL样品勾液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。 5.3.2样品勾液移人平皿后，应及时将凉至48℃左右的RPF琼脂培养基（可放置于48℃士1℃恒温 水浴箱中保温)注入平皿约15mL～20mL，并转动平皿使混合均匀。同时将RPF琼脂培养基倾人加 2 豆丁网国内外标准大全 http://www.docin.com/kmust1. SN/T2154—2008 有1mL空白稀释液的无菌平皿内作对照。 5.3.3待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃土1℃培养箱，培养24h～48h。 5.4典型菌落计数 5.4.1凝固酶阳性葡萄球菌在RPF琼脂培养基平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外围有沉淀晕环。 注：菌落色泽与葡萄球菌还原亚酸钾的能力相关，大部分金黄色葡萄球菌形成黑色或灰色菌落，其他不还原亚碲 酸钾的葡萄球菌则为白色菌落。凝固酶阳性的葡萄球菌产生的凝固酶将纤维蛋白原分解为不溶性纤维蛋白， 使菌落外围出现沉淀晕环。 5.4.2选择菌落数在15~300之间的平板，挑典型菌落计数（见5.4.1描述），按平均典型菌落数乘以 稀释倍数计算。 5.4.3若有两个连续稀释度在适宜计数范围内时，按式（1)计算： ZC N: (1) (n, +0.1n,)d 式中： N---样品中菌落数； ZC 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； 适宜范围菌落数的第一稀释度（低）平板个数； n 适宜范围菌落数的第二稀释度（高）平板个数； n2 稀释因子（适宜范围菌落数的第一稀释度）。 示例： 稀释度 1：100（第一稀释度） 1+1000（第二稀释度） 菌落数 66,54 4,7 Zc N : (n,+0.1n,)d =(66+54+4+7)/[(1×2+0.1×2)×10-2 =5 955 上述数据经“四舍五入”后，表示为6000或6.0×103。 5.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于15，则应按最低稀释度的平均典型菌落数乘以稀释倍数 计算。 5.4.5若所有稀释度（包括液体样品原液）的平板均无典型菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数 计算。 6凝固酶阳性葡萄球菌菌落总数的报告 6.1菌落数在100以内时，按“四舍五人”方式修约，采用两位有效数字报告。 6.2大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”方式修约后，取前2位数字，后面用0代替位数 来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五人”方式修约，采用两位有效数字。 6.3若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 6.4固体或半固体样品以CFU/g为单位报告结果，液体样品以CFU/mL为单位报告结果。 第二法MPN法 7检验程序 检验程序见图2。 3 豆丁网：国内外标准大全 http://www.docin.com/kmust1. SN/T 2154—2008 检样 25g(mL)样品十225mL蛋白陈氯化钠溶液，均质 10倍系列稀释 选择3个适宜的稀释度，分别吸取1mL样品匀液 于改良GC肉汤，每个稀释度各接种3管 36℃±1℃ 24 h~48 h 接种RPF琼脂培养基平板 36℃±1℃ 24 h~48 h 查MPN表 报告结果 图2凝固酶阳性葡萄球菌MPN法检验程序 8操作步骤 8.1接种及培养 8.1.1分别在做10倍递增稀释的同时，选择适宜的3个连续稀释度的样品勾液（液体样品可包括原 释度接种3管，如需做双料，则应吸取10mL样品匀液，接种到10mL改良GC肉汤管。每个试管中均 加入适量冷却至48℃左右的无菌水琼脂或石蜡，凝固后使形成密封状态。要求样品的最高稀释度，能 达到获得阴性终点。将上述接种物36℃土1℃培养24h士2h。 8.1.2如试管中的液体变色或出现黑色沉淀，用3mm接种环移取1环，分别划线接种RPF琼脂培养 基平板，36℃土1℃培养，24h48h；如试管中的液体没有产生黑色沉淀或变色，则继续培养24h土 2h，培养至48h后，无论试管有无变黑，均需用接种环分别划线接种RPF琼脂培养基平板，36℃士 1℃培养，24h～48h后观察结果。