SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2102.4—2008/IS0 20838:2006 食源性病原体PCR检测技术规范 第4部分：定性检测方法扩增和检测要求 Polymerasechain reaction(PCR) for the detection of food-borne pathogens- Part 4:Requirements for amplification and detection for qualitative methods [ISO 20838:2006,Microbiology of food and animal feeding stuffs- Polymerasechainreaction(PCR)for thedetectionoffood-bornepathogens Requirements for amplification and detection for qualitativc mcthods,MODJ 2009-02-01实施 2008-07-17发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2102.4—2008/ISO20838:2006 前 SN/T2102《食源性病原体PCR检测技术规范》共分为四个部分： 第1部分：通用要求和定义； 第2部分：PCR仪性能试验要求； 一第3部分：定性检测方法样品制备要求； -第4部分：定性检测方法扩增和检测要求。 本部分为SN/T2102的第4部分。 本部分修改采用IS020838：2006《食品与动物饲料微生物学 食源性病原体PCR检测 定性检 测方法扩增和检测要求》，并做了如下修改： 对“前言”和“引言”进行了修改； 对“规范性引用文件”的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改； 在"术语和定义”部分加入了实时荧光PCR、实时荧光RT-PCR和RT值等三个定义； 在“试剂”部分加人了“探针”和“荧光染料”； 在7.5加入了对探针设计的要求； 将标准中的国际标准用相应的国家标准或行业标准替代，如GB/T27025替代ISO17025； 将“警告”改为“安全要求，并放置到标准的末尾段”； 删除了标准后的参考文献。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分由中华人民共和国广西出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人 民共和国山西出入境检验检疫局、中华人民共和国河南出入境检验检疫局负责起草。 本部分主要起草人：刘军义、祝长青、罗兆飞、李卫华、韦梅良、张建军、苗丽。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T2102.4—2008/1S0208382006 引 言 通过目标核酸的扩增和检测可确定样品中是否存在特定的核酸。检测结果的准确性取决于对照控 制的有效性和所用方法的检出限。 ISO20838：2006，由欧洲标准委员会（CEN)食品分析水平方法技术委员会（CEN/TC275）与食 物产品技术委员会（ISO/TC34)微生物小组委员会（SC9)依照ISO和CEN技术合作协议联合制定。 本部分修改采用ISO20838：2006，为《食源性病原体PCR检测技术规范》的第4部分，规定了定性 PCR技术对食品、饲料、环境样品中病原体的目标核苷酸序列进行扩增、检测和确认的通用要求。 SN/T2102.4—2008/IS020838:2006 食源性病原体PCR检测技术规范 第4部分：定性检测方法扩增和检测要求 1范围 SN/T2102的本部分规定了使用PCR技术定性检测食源性病原体的基本准则。包括对目标核酸 序列特异性扩增、检测和确认的通用要求。其目标是确保不同的实验室得到的检测结果具有重复性和 再现性。 本部分适用于食品和饲料中病原体的PCR扩增和检测，环境样品和微生物菌株等其他样品的 PCR检测也可参照使用。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T2102的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 SN/T2102.1一2008食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义 ISO16140食品和动物饲料微生物学替代方法确认程序 3术语和定义 SN/T2102.1确立的以及下列术语和定义适用于SN/T2102的本部分。 3. 1 实时荧光聚合酶链式反应 rtal-timefluorescence,PCR 在常规的聚合酶链式反应的混合物中添加非特异性荧光染料或者特异性荧光探针，通过检测每次 循环中的荧光发射信号，间接反映了PQR扩增的目标基因的量，记录整个PCR进程，确定Ct值，分析 并得出检测结果。 3. 2 实时荧光逆转录聚合酶链式皮应 real-timefluorescendeRT-PCR 在常规的逆转录聚合酶链式反应的混合物中添加非特异性荧光染料或者特异性荧光探针，通过检 测每次循环中的荧光发射信号，间接反映了.PCR扩增的目标基因的量，记录整个PCR进程，确定Ct 值，分析并得出检测结果。 3.3 Ct值cyclethreshold 每个反应管/孔内的荧光信号超过仪器能够检测到的最低信号，达到设定的域值时，开始表现明显 的指数扩增时所对应的PCR循环数。 4原则 通过对样品中目标核苷酸序列的筛选和特异性检测，将病原体鉴定到属、种或更低的分类水平。在 方法检出限范围内使用适当的对照能定性检测出目标序列是否存在。检测步骤如下： a）特异性目标序列的PCR扩增； SN/T2102.4—2008/ISO20838:2006 b）PCR产物的检测； c）PCR产物的确认； d）使用微生物培养法确认。 5试剂 通常情况下使用适合于分子生物学反应的分析纯试剂。建议配制PCR方法所需的等份反应溶液， 并在适当的条件下（如一20℃）储存待用。 5.1DNA聚合酶 用于PCR反应的耐热聚合酶（可具有反转录活性）。它可以是一种经纯化的天然活性酶，也可以是 一种经纯化的基因工程重组酶。不同的DNA聚合酶需要不同的实验条件。如使用不同的缓冲液、温 度等。并应按照说明书使用。 5.2逆转录酶 这种酶将RNA转录为与之互补的单链DNA(cDNA），后者用于随后的PCR扩增。并应按照说明 书使用。 5.3反应缓冲液 应按照聚合酶使用说明书使用适当的反应缓冲液，即用型缓冲液可直接购买。用于制备PCR反应 缓冲液的物质在储存和PCR循环过程中应具有稳定性。并应按照说明书使用。 5.4用于PCR反应的脱氧核糖三磷酸腺苷（dNTP） 根据需要选用含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP和（或）dUTP的混合液。这些物质在储存和PCR 循环过程中应具有稳定性。这些试剂已经商业化，可从供应商处购买。 5.5引物 应根据食源性病原体特异性DNA序列选择引物。 5.6探针 与检测模板序列匹配、有荧光基团标记的8个～30个核苷酸不等的核酸序列。 5.7荧光染料 能与双链DNA结合增强自身荧光能力的一种染料。 5.8水 用于扩增反应的水应不含DNA酶和RNA酶。超纯水可从供应商处购买。 5.9氯化镁 可作为反应缓冲液的成分，也可以作为单独试剂。 5.10检测PCR产物的化学物质 PCR方法中用于检测体系的化学物质应符合质量要求。 5.11矿物质油 在反应混合液表面覆盖矿物质油可防止热循环过程中反应液的蒸发。 5.12促进剂 在PCR反应液中加入的用于减少基质衍生物对PCR反应产生抑制作用的物质，如聚乙二醇或牛 血清蛋白等。 5.13RNA酶抑制剂 用于核酸提取过程的试剂和塑料管可能被RNA酶污染，在RT-PCR反应中加入RNA酶抑制剂 可防止目标RNA序列被RNA酶降解。RNA酶抑制剂可从供应商处购买。 5.14防止带出PCR产物的试剂 为进一步防止污染，在PCR体系中加人去污染处理体系（如使用dUTP和UNG酶）可将PCR产 物带来的污染风险减到最小。 2 SN/T2102.4—2008/ISO20838:2006 6器具和设备 除常规实验室设备（见SN/T2102.1），还应具备以下特殊设备和器具： - 6.1PCR仪 应能准确地完成PCR方法所规定的温度和时间的循环条件。 6.2移液器 配备滤芯吸头，至少需要三套移液器，用途如下： 样品核酸制备； 预混液及反应体系的制备； 电泳检测。 注：电泳检测步骤不需要带滤芯吸头。 6.3反应容器 应适用于热循环反应，加热到100℃或冷却到4℃均不会发生破损。 6.4PCR产物检测体系 6.4.1用于琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳仪和检测DNA电泳带的紫外照射光源。 6.4.2核酸柱色谱仪及其适当的检测系统。 6.4.3包被了探针的固相系统和PCR产物检测仪。 6.4.4其他等同的检测设备。 7操作程序 7.1PCR扩增 在DNA聚合酶催化、寡核苷酸引物和脱氧核糖三磷酸腺苷参与下，特异性核酸序列的扩增反应可 在体外特定的反应缓冲液中进行。目标核苷酸序列扩增的重要前提是反应中不存在DNA聚合酶的抑 制作用。检测RNA时，先用反转录酶将RNA序列转化成互补的DNA序列，然后进行PCR检测。 DNA的扩增是包括以下步骤的循环过程： 通过加热将双链DNA变性为单链核苷酸； 荧光标记探针与/或引物在适当的温度下附着于两条互补的单链DNA上（退火）； 在适当温度下，引物在DNA聚合酶作用和脱氧核糖三磷酸腺苷参与下延伸。 7.2PCR产物的检测和确认 用琼脂糖凝胶电泳或适当的替代方法检