SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1918—2007 牛传染性鼻气管炎聚合酶链 反应操作规程 Protocol of polymerase chain reaction for infectious bovine rhinotracheitis 2007-12-01实施 2007-05-23发布 中华人民共和国 发布 数码防伪 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1918—2007 前 言 本标准参考了OIE《陆生动物疫病诊断试验和疫苗标准手册》。 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：段宏安、张睿、姚燕林、王振国、周毅、王海涛、王伟利、李金华、刘小琴。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T1918—2007 牛传染性鼻气管炎聚合酶链 反应操作规程 范围 本标准规定了牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应检测方法。 本标准适用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测， 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T66822 分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696：1987） GB/T18088出人境动物检疫采样 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 3缩略语 下列缩略语适用于本标准。 3. 1 IBR infectious bovine rhinotracheitis 牛传染性鼻气管炎。 3. 2 BHV1bovineherpesvirus type1 牛疱疹病毒1型。 3. 3 MDBKMadin-Darbybovinekidneycell line 牛肾传代细胞系。 3. 4 PCR Polymerase chainreaction 聚合酶链反应。 3. 5 BSAbovine serumalbumin 牛血清白蛋白。 3. 6 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷二磷酸。 3.7 dATPdeoxyadenosine triphosphate 脱氧腺苷三磷酸。 SN/T1918—2007 3. 8 dCTPdcoxycytidine triphosphate 脱氧胞苷三磷酸。 3.9 dGTPdeoxyguanosine triphosphate 脱氧鸟苷三磷酸。 3. 10 dTTP deoxythymidine triphosphate 脱氧胸苷三磷酸。 3. 11 bpbase pair 碱基对。 3. 12 ddH,O double distilled water 双蒸水。 3. 13 EDTAethylene diaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸。 3.14 TaqDNApolymerase TaqDNA聚合酶。 3. 15 CPEcytopathic effect 致细胞病变效应。 原理 牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛疱疹病毒1型(BHV1)引起的牛的急性病毒性传染病。患牛康复 后仍可长期带毒，生殖系统感染后，病毒可在阴道及包皮粘膜中繁殖，精液中可能含有病毒。通过对采 集病料的处理，提取病毒DNA，以病毒gB和gE基因片段为靶基因进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳检 测PCR扩增产物，以确定样品中是否含有BHIV1病毒。 5试剂和材料 除另有规定外，水为双蒸水或超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格，并经过121℃、30min高 压灭菌；试剂为分析纯或生化试剂。 5.1琼脂糖(电泳纯)。 5.2溴化乙锭(EB)。 5. 3 三氯甲烷。 5. 4 异戊醇。 5.5 异丙醇。 75%乙醇。 5.6 5.7 正汀醇。 5. 8 Taq酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化 5.9 DNA分子量标准（DNAMarker）：50bp～500bp，须在250bp、500bp处各有一条带。 2 SN/T1918—2007 5.10PBS(pH7.2)溶液、红细胞裂解液、5%Chelex-100溶液、精子裂解液、TE缓冲液、dNTP、引物、 10×PCR反应液、电泳缓冲液、10X加样缓冲液、溴化乙锭核酸染色液配制方法参见附录A。 6主要仪器 6.1PCR扩增仪。 6.2无菌室、超净工作台或通风橱。 6.3消毒灭菌锅。 6.4恒温水浴箱。 6.5高速冷冻离心机。 6.6台式小型离心机。 6.7 低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。 6.8 纯水器或超纯水器。 旋涡混合器。 6.91 6.10移液器。 6. 11 电泳仪。 6. 12 紫外分析仪或凝胶成像系统。 6.13pH计。 6.14组织研磨器或手持式均质器。 7操作方法 7.1样品处理及病毒DNA提取 7.1.1临床样品处理：临床取鼻拭子、阴道拭子等，剖检取病变组织。拭子样品悬于PBS.放人少量玻 璃珠，旋涡混合，1000r/min离心5min，取上清备用；组织样品取3g置于5mLPBS中均质， 1000r/min离心5min，取上清备用。 7.1.2血凝块及全血处理：取出装有血凝块的采血管，将手持式均质器的均质头置人灭菌双蒸水中清 洗后，浸入无水酒精中清洗，于火焰上烧灼至干，浸入灭菌PBS中冷却，置于血凝块中均质，直至无团块 状物存在。全血（抗凝血)不需均质处理，全血及血凝块均质液加入红细胞裂解液至满管，充分混匀，置 于冰上15min，1600r/min～2000r/min离心5min～10min，去上清液，如沉淀仍有血凝块，可用红细 胞裂解液反复裂解直至无血凝块存在，细胞沉淀用PBS洗涤一至二次后，加入1倍体积的PBS悬浮细 胞备用。 7.1.3细胞培养物处理：取接种样品后出现CPE或可疑的细胞培养物三次冻融，取细胞悬液500μL， 经2000r/min离心10min，去上清液，取沉淀备用。 7.1.4前处理后样品中病毒DNA提取：取另一支灭菌的微量离心管，按不同样品加上述处理好的 样品和5%Chelex-100溶液：临床样品上清液50μL，5%Chelex-100溶液150μL；血凝块及全血样品制 备的细胞悬液100μL，5%Chelex-100溶液100μL；细胞培养物离心后的沉淀可直接加入5%chelex 100溶液200L，旋涡混勾，56℃~60℃孵育20min，旋涡混合10s，98℃水浴8min10min，旋涡混合 10s，置于冰上冷却3min，15000r/min离心2min。取上清液5μL用于PCR反应。剩余部分置于 4℃短期或一20℃长期保存备用。 7.1.5精液中病毒DNA提取：用火焰上烧灼过的剪刀将冻精管剪断、将精液（约150uL)收集于 心30s，上清液中加入等量的6mol/LNaCl,混合5s，室温下静置5min，混合物中加人1.4倍的三氯甲 烷：异戊醇（24：1），混合1min，12000r/min离心5min，上清液中加人0.6倍体积的异丙醇， 12000r/min室温下离心15min，沉淀用正丁醇纯化，沉淀重悬于100μLTE缓冲液，加人10倍体积的 3 SN/T1918—2007 正丁醇，12000r/min室温下离心3min，最终沉淀溶于50μLTE中，通常取10μL用于PCR。 7.1.6样品中病毒DNA的提取可选用其他合适DNA抽提方法或商品化试剂盒提取病毒DNA。 7.1.7检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。 7.2PCR扩增 7.2.1反应体系体积为50μL，dNTP(10mmol/L)1=L、引物（各10μmol/I.)各0.5μl.、10×PCR缓 冲液5μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL、模板DNA(0.1μg1.0μg)10μL、水33μL。使用不同 PCR扩增仪，可对参数作适当调整。 7.2.2反应条件：反应在PCR扩增仪中进行，首先在94℃预变性3min，随后在96℃变性1min，60℃ 退火45s，72℃延伸45s条件下进行10个循环，在96℃变性1min，54℃退火45s，72℃延伸45s条件 下进行15个循环，然后在96℃变性1min，57℃退火45s，72℃延伸45s条件下进行10个循环，经72℃ 延伸10min结束反应，反应条件对不同PCR扩增仪可经反复优化确立。 7.2.3检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用含BHV1病毒的细胞培养悬液和正常 MDBK细胞培养物按7.1.3和7.1.4提取DNA分别作阳性对照和阴性对照，空白对照除以双蒸水代 替模板外，测定步骤相同。 7.3琼脂糖凝胶电泳 取0.5g，于25mL电泳缓冲液中加热，充分落化，加人漠化乙锭至终浓度为1μg/mL，制胶。在电 泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将10μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合， 点样。9V/cm恒压，电泳20min~30min。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。 8结果判定 8.1PCR扩增产物电泳检测结果：BHV1的gB基因PCR扩增产物为491bp;BHV1的gE基因PCR 扩增产物为271bp。 8.2PCR扩增产物电泳未出现特异性条带时，未检出BHV1病毒。 8.3PCR扩增产物电泳两者之一或均出现特异性条带，检出BHV1病毒。 8.4必要时，进行PCR扩增产物测序，进行确认试