SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1917--2007 牛地方流行性白血病 聚合酶链反应操作规程 Protocol of polymerase chain reaction for enzootic bovine leukemia 2007-12-01实施 2007-05-23发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T 1917—2007 前 言 本标准参考了OIE《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》。 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：段宏安、张睿、周毅、姚燕林、王海涛、李金华、刘小琴。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 19172007 牛地方流行性白血病 聚合酶链反应操作规程 1范围 本标准规定了牛地方流行性白血病聚合酶链反应检测方法。 本标准适用于牛地方流行性白血病的检测。 规范性引用文件 2 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696：1987） SN/T1193 基因检验实验室技术要求 缩略语 3 下列缩略语适用于本标准。 3. 1 BLV Bovine Lenkemia Virus 牛白血病病毒 3. 2 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应。 3. 3 BSAbovine serumalbumin 牛血清白蛋白。 3. 4 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸。 3.5 dATPdeoxyadenosinetriphosphate 脱氧腺苷三磷酸。 3. 6 dCTP deoxycytidine triphosphate 脱氧胞苷三磷酸。 3. 7 dGTPdcoxyguanosine triphosphate 脱氧鸟苷三磷酸。 3. 8 dTTPdeoxythymidine triphosphate 脱氧胸苷三磷酸。 SN/T1917—2007 3. 9 bpbase pair 碱基对。 3. 10 ddH,Odouble distilled water 双蒸水。 3. 11 EDTAethylene diaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸。 3. 12 Taq酶 每TaqDNApolymerase TaqDNA聚合酶。 3. 13 TBE Tris-HCI、borate、EDTA缓冲液。 3. 14 Tris tris(hydroxymethyl)aminomethane 三(羟甲基)氨基甲烷。 3. 15 FLKfetal lambkidney 羊胎肾细胞 3.16 CPE cytopathic effect 致细胞病变效应。 4 方法原理 牛地方流行性白血病是由牛白血病病毒（BIV)引起的疾病，牛在任何年龄段均可感染，病毒以前 病毒的形式整合于宿主细胞DNA，存在于血液淋巴细胞和肿瘤细胞中。病毒也在各种体液包括鼻液、 气管液、唾液和牛奶等的细胞成分中发现。从抗凝全血样品中分离的外周血淋巴细胞、血沉棕黄层或冷 冻的全血以及肿瘤细胞均可用于提取病毒核酸，先用一对外侧引物扩增BLV目的基因gp51(env)的- 个大片段，再用一对内侧引物以大片段为模板进行第二次扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物， 以确定样品是否含有BLV。 5试剂和材料 5.1双蒸水应符合GB/T6682中一级水规格。 5.23 琼脂糖（电泳纯）。 5.3 漠化乙锭（EB)。 Taq酶：5U/uL。一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 5.5DNA分子量标准（DNAMarker）：50bp~500hp，须在320bp～360hp之间至少有一条带。 5.6BLV阳性对照：可取BLV持续感染的FLK细胞提取DNA用于PCR反应阳性对照，或由指定单 位提供。 5.7PBS(pH7.2)溶液、红细胞裂解液、淋巴细胞分离液、TE缓冲液、dNTP、引物、10XPCR反应液、 电泳缓冲液和10X加样缓冲液参见附录A。 2 SN/T1917-2007 6主要仪器 6.1微量可调移液器。 6.2PCR扩增仪。 6.3无菌室、超净工作台或通风橱。 6.4消毒灭菌锅。 6.5离心机。 6.6冰箱。 6.7 纯水器或超纯水器。 6.8旋涡混合器。 6.9电泳仪。 6.10 紫外分析仪或凝胶成像系统。 6. 11 紫外可见分光光度计或核酸蛋白分析仪。 6.12 手持式均质器。 试验方法 7.1样品处理 7.1.1抗凝血处理 取淋巴细胞分离液轻轻加到等量的抗凝血上，注意不要摇动打乱液层，2000r/min离心20min，离 心后分成多层，最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞，在血浆层与分离液之间是一层较致 密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放人另一离心管中，以PBS洗涤后备用，若暂 时不能实验时将样品冻结保存。 7.1.2血凝块处理 取出装有血凝块的采血管，将手持式均质器的均质头置人灭菌双蒸水中清洗后，浸入无水酒精中清 洗，于火焰上烧灼至干，浸人灭菌PBS中冷却，置于血凝块中均质，直至无团块状物存在。血凝块均质 液加入等量红细胞裂解液充分混匀，置于冰上15min，加人冷至2℃～8℃的灭菌双蒸水至满管，如加人 红细胞裂解液后已满管，可先行离心后再加火菌双菌水，颠倒混匀，1500r/min离心5min，去上清液， 如沉淀仍有血凝块，可用红细胞裂解液裂解直至无血凝块存在，细胞沉淀用PBS洗涤二次后备用。 7.1.3肿瘤或其他组织处理 将肿瘤或其他组织加人PBS成10%的匀浆液，1000r/min离心5min，取上清备用。 7.1.4细胞培养物处理 刮取样品接种后出现CPE或可疑的细胞培养物500μL，经2000r/min离心10min，去上清，取沉 淀备用。 7.1.5检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。 7.2病毒DNA提取 7.2.1取微量离心管，每管加100uL5%chelex-100溶液，再加人7.1中处理好的样品、阳性、阴性对 照各100μL，细胞培养物离心后的沉淀可直接加人chelex-100溶液，旋涡混匀，56℃～60℃孵育 20min，旋涡混合10s，98℃水浴10min，旋涡混合10s，置于冰上冷却3min，15000r/min离心2min。 取上清5μL.用于PCR反应。剩余部分置于4℃短期或一20℃长期保存备用。 7.2.2可选用其他合适DNA抽提方法或商品化试剂盒提取DNA。 7.3套式PCR扩增 7.3.1一次PCR反应体系 在PCR反应管中配制一次PCR反应体系：10×PCR缓冲液5μL、dNTP1μL、BLV1A和BLV6A SN/T1917—2007 各1μL、Tag酶0.5μL、DNA提取物5μL、水36.5μL，总体积50μL。反应体系中各试剂浓度可进 步优化，使用不同PCR扩增仪，可对参数作适当调整。 7.3.2一次PCR反应条件 反应在PCR扩增仪中进行，首先94℃变性45s，60℃退火60s，72℃延伸90s，进行5次循环，随后 94℃变性45s，55℃退火60s，72℃延伸903，进行30次循环，经72℃延伸10min结束反应。 7.3.3二次PCR反应体系 在PCR反应管中配制二次PCR反应体系：10×PCR缓冲液5μL、dNTP1μL、BLV3和BLV5各 1μL、Tag酶0.5μL、一次PCR扩增产物5μL、水36.5μL，总体积50μL。 7.3.4二次PCR反应条件 反应在PCR扩增仪中进行，首先94℃变性45s，58℃退火60s，72℃延伸90s，进行5次循环，随后 94℃变性45s，55℃退火60s，72℃延伸90s，进行30次循环，经72℃延伸10min结束反应。 7.4琼脂糖凝胶电泳 用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳 缓冲液淹没胶面。将8uL二次PCR扩增产物和2μL电泳缓冲液混勾后加入样品孔。在电泳时设立 DNA分子量标准作对照。5V/cm电泳0.5h。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。 8结果判断 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，阳性对照检测出341bp大小的条带，阴性和空白对照未出现 条带。 样品扩增出341bp大小的条带即可判断为阳性结果，必要时，取PCR产物扩增产物测序，与参考 序列（参见附录B)同源性在95%以上，可确证为阳性结果。如果条带大小不在341bp位置或无条带即 可判断为阴性结果。 SN/T19172007 附录A （资料性附录） 试剂配制 A.1PBS溶液(pH7.2) 氯化钠(NaCI)8.5g，氯化钾（KCI)0.2g，磷酸氢二钠（NazHPO·12H,O)2.85g，磷酸二氢钾 (KHzPO.)0.27g，定容至1000mL双蒸水中，调pH至7.2，灭菌备用。 A.2红细胞裂解液 0.15mol/LNH,CI-0.01mol/LKHCO,-0.001mol/LNaz-EDTA A.35%Chelex-100溶液 称取5gChelex-100，定容至100mL蒸馏水中，移取时，边搅拌边用灭菌的1000μ