SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1800—2006/ISO4833:2003 食品和动物饲料微生物学 30℃菌落计数方法 Microbiology of food and animal feeding stuffs- Colony-count method at 30℃ (ISO 4833:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal methodfor the enumeration of microorganisms Colony-count techniqueat3o,IDT) 2006-08-28发布 2007-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1800—2006/ISO4833:2003 前言 本标准等同采用ISO4833：2003《食品和动物饲料微生物学- 一微生物30℃菌落计数方法》（英 文版）。 为便于使用，本标准做了下列编辑性修改： a）用“本标准”代替“本国际标准”； b）用小数点符号“”代替小数点符号，”； c）删除国际标准的前言。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局、中国实验室国家认可委员会。 本标准主要起草人：李志培、李宏、江志毅、乔晴、杨向莹、苗丽。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T1800—2006/IS04833:2003 食品和动物饲料微生物学30℃菌落计数方法 1范围 本标准规定了在30℃需氧培养的固体培养基上的菌落计数方法。 本标准适用于人类食品和动物伺料。本标准不适用于检测发酵的食品和动物饲料。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 SN/T1538.1--2005培养基制备指南第1部分：实验室制备培养基制备质量保证通则 (ISO/TS11133-1:2000,MOD) ISO6887（所有部分） 食品和动物饲料微生物学微生物学检验样品的制备，初始悬液和十倍 稀释液 ISO7218:1996食品和动物饲料微生物学——微生物学检验通用规则 ISO8261乳和乳制品一 一微生物学检验样品的制备，初始悬液和十倍稀释液的通用指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 微生物microorganism 在本标准规定的条件下形成可计数菌落的细菌、酵母菌和霉菌。 4原理 4.1如果产品是液体；用规定的培养基和规定量的样品制备两个倾注平板，如果是其他产品则用规定 量的初始悬液制备。 在相同条件下，用十倍稀释的检验样品或初始悬液制备另一对倾注平板。 4.2将平板置30℃需氧培养72h。 4.3计算所选择的平板上的菌落数，得出每毫升或每克样品中的微生物数量（见第10章）。 5培养基和稀释 普通实验室的操作见ISO7218和SN/T1538.1—2005。 5.1稀释 见ISO6887的有关部分。 5.2平板计数琼脂(PCA) 5.2.1成分 5.0 g 酶解酪蛋白 2.5 g 酵母浸膏 SN/T1800—2006/ISO4833:2003 无水葡萄糖（CsH12O） 1.0g 琼脂 9g～18g（根据琼脂的硬度） 水 1000mL 如果检验乳品，每升培养基中加1.0g脱脂乳粉。脱脂乳粉不应含有抑菌物质。 5.2.2制备 5.2.2.1商售脱水培养基的制备 按照制造商的说明书制备，必要时增加脱脂乳粉（见5.2.1）。 必要时调整pH，使其灭菌后在25℃时的pH为7.0土0.2。 5.2.2.2脱水成分制备 按照以下顺序加入和溶解：酵母浸膏、酶解酪蛋白、葡萄糖，必要时加脱脂乳粉。加热溶解。 加琼脂并加热至沸腾，直到琼脂完全溶解。 必要时调整pH,使其灭菌后在25℃时pH为7.0士0.2。 5.2.2.3分装、灭菌和贮存 将培养基分装到试管（6.8）中，每管12mL～15mL，或者分装到容量不大于500mL的瓶子 (6.8)里。 于高压灭菌锅中121℃灭菌15min。 如果培养基要直接使用，可于使用前在水浴（6.5）中冷却至44℃～47℃。如果不使用，可贮存在 3℃士2℃的暗处，不超过3个月，在此条件下培养基的成分和特性不会有任何改变。 微生物检验开始前，为防止在倾注培养基时耽误时间，将培养基完全溶解，使用前在44℃～47℃的 水浴(6.5)中冷却。 为了检查培养基的温度，建议将一支温度计放进盛有琼脂浓度为15g/L对照溶液的容器中，该容 器与装培养基的容器相同。两者的加热和冷却操作的程序相同。 5.2.3培养基质量保证的性能检验 检查培养基的性能，见SN/T1538.1一2005。 5.3覆盖培养基（如果需要；见9.2.7) 5.3.1成分 琼脂 12 g~18 g 水 1000mL 5.3.2制备 将琼脂加到水中，加热至沸或于蒸汽中30min，使琼脂完全溶解。 必要时调整pH，使其灭菌后在25℃时的pH为7.0士0.2。 5.3.3分装、灭菌和贮存 将培养基分装到试管中(6.8)，每管4mL，或分装到适当容量的瓶子里。在高压灭菌锅中121℃灭 菌15min。 如果培养基要直接使用，可于使用前在水浴（6.5)中冷却至44℃～47℃。如果不使用，可贮存在 3℃士2℃的暗处，不超过3个月，在此条件下培养基的成分和特性不会有任何改变。 微生物检验开始前，为防止在倾注培养基时耽误时间，将培养基完全溶解，使用前在44℃～47℃的 水浴(6.5)中冷却。 6设备和玻璃器血 如果规格合适，可以用一次性玻璃器血替代重复使用的玻璃器皿。普通实验室的设备和器皿如下： 6.1干燥灭菌箱或湿热灭菌锅。见ISO7218。 6.2培养箱，温度30℃士1℃。 2 SN/T1800—2006/ISO4833:2003 6.3平皿，玻璃或塑料制品，直径90mm~100mm。 6.4吸管，容量1mL。 6.5水浴，温度44℃~47℃。 6.6菌落计数器，具有暗背景和底部照明，装有大约1.5倍的放大镜和机械或电子计数器。 6.7pH计，在25℃时准确到0.1pH单位。 6.8适当容量和不大于500mL试管、瓶子。 7取样 重要的是实验室接受的样品确定具有代表性并且在运输或存期间没有受到损害。 不在本标准中规定的取样方法，参见有关产品所涉及的专门的国际标准。如果没有专门的国际标 准，建议有关各方在此问题上达成一致。 8检验样品制备 检验样品的制备按照ISO6887或ISO8261的相应部分以及指定的有关产品的标准进行，如果没 有指定的国际标准，建议有关各方在此问题上达成一致。 9程序 9.1检验部分（初始悬液和稀释液） 参见ISO6887的相应部分和有关产品涉及的指定的标准。 9.2接种和培养 9.2.1取2个无菌平血（6.3)，用无菌吸管（6.4)各取1mL液体样品放人每个平皿中，如果是其他产 品则取1mL初始悬液加人（10-1稀释液）。 9.2.2另取2个无菌平血（6.3)，用另一支无菌吸管（6.4)各取1mL液体样品的10-1稀释液加入每个 平皿，或各加人1mL其他样品的10-²稀释液。 9.2.3如需要，用一支新的无菌吸管吸取下一个十倍稀释液，重复该程序。 9.2.4如果适当和可能，只选择临界的稀释液（至少选2个连续的十倍稀释液)接种到平皿中，使每个 平板长出15个～300个菌落。 9.2.5往每个平Ⅲ中倾注44℃～47℃的平板计数琼脂（5.2)12mL～15mL。从制备初始悬液（如果 产品是液体则为10-1稀释液)结束到培养基倾注到平血的时间不能超过45min。 9.2.6转动平皿，小心混合接种物和培养基，将平皿放在凉的水平面上使其凝固。 9.2.7完全凝固后，只有怀疑所检产品中的微生物的菌落在培养基表面蔓延生长时，才在接种培养基 的表面倾倒大约4mL的复养培养基（5.3）。如上述使其凝固。 9.2.8将制备的平板反转并放置在培养箱中（6.2)，30℃士1℃，72h士3h，平板叠放不要超过6个高 度。每擦平板应互相离开并和培养箱的壁、顶保持距离。 9.3菌落计数 9.3.1规定的培养期后(9.2.8)，计数平板(10.1)上的菌落，必要时使用菌落计数器（6.6)。在柔和的 光下检查平板。需要强调的是，应当计数针尖状的菌落，操作者应认清在平板中没有溶解的或沉淀的干 扰颗粒。仔细检查可疑物质，需要时用较高倍数的放大镜，以区别菌落和外来物质。 9.3.2蔓延菌落应作为单个菌落计算。如果蔓延菌落的生长小于平板的四分之一，计数平板上没有受 影响的部分的菌落，并推算整个平板上相应的菌落数。如果蔓延菌落的生长大于平板的四分之一，则放 弃计数。 3 SN/T1800—2006/ISO4833:2003 10结果的表示 10.1计算方法 见ISO7218：1996标准的修正案1。 10.2精密度 10.2.1概述 对大于15个和小于300个菌落的平板作精密度评价。精密度取决于菌落群体和样品基质。现有 的数据来源于协同研究(参见参考文献[1]、[2]和[3])并且对生的和巴氏杀菌乳是认可的。它们被用于 其他产品菌落计数的评估。 10.2.2重复性 使用相同方法，在同一实验室检测同一种物质，由同一操作者使用同一设备在短时间内的两次独立 的单次试验结果的绝对差值，不应大于重复性限，r=