SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T17362006 进出口蜂蜜中黄曲霉毒素的检验方法 高效液相色谱法 Inspection of aflatoxins in honey for import and export- High performance liquid chromatography 2006-01-26发布 2006-08-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T1736-2006 前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局， 本标准主要起草人：杨冀州、刘朝晖、刘亚风、郭俊峰、李全滋 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准 1 SN/T1736—-2006 进出口蜂蜜中黄曲霉毒素的检验方法 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了进出口蜂蜜中黄曲霉毒素检验的抽样、制样和高效液相色谱法的测定方法。 本标准适用于进出口蜂蜜中黄曲霉毒素BI、B2、G和G2的检验 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。 S.N/T0852进出口蜂蜜检验方法 3抽样和制样 抽样和制样按SN/T0852的规定进行。 4测定方法 4.1方法提要 试样中的黄曲霉毒素B、B2、G，和G用甲醇十水（7十3)提取，提取液经稀释、过滤后.用免疫亲和 柱净化。带荧光检测器和柱后衍生装置的高效液相色谱仪测定各种黄曲霉毒素，外标法定量。 4.2试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 4.2.1甲醇。 4.2.2甲醇,HPLC级。 4.2.3氯化钠。 4.2.4甲醇+水（7+3)：取700ml甲醇（4.2.1)加300mL水， 4.2.5黄曲霉毒素免疫亲和柱。 4.2.6黄曲霉毒素标准品（黄曲霉毒素B、B、G，、G2）：纯度≥99%。 4.2.7黄曲霉毒素标准储备液：用甲醇（4.2.2)分别配制0.100mg/mL.的黄曲霉毒素Bi、B、G、G 标准储备液，冷藏备用。 4.2.8黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素B、B2、GI、G2标准储备液，用甲醇 （4.2.2)稀释成混合标准工作液 4.2.9柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）：称取0.1g碘，溶解于20ml.甲醇后，加纯水定容至200ml..以 0.45μm的尼龙滤膜过滤，冷藏避光保存。 4.3仪器和设备 4.3.1高速均质器。 4.3.2高效液相色谱仪，配有荧光检测器和柱后衍生化装置。 4.3.3玻璃针筒：20ml.。 4.3.4空气压力泵。 SN/T1736—2006 4.3.5玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。 4.3.6针筒式滤膜：0.45um。 4.4测定步骤 4.4.1提取 称取试样约25g（精确至0.1g)于250ml均质杯中，加人5g氯化钠及125mL甲醇十水（4.2.4)，以 均质器高速搅拌提取5min，取15ml.提取液，加人30mL水，混匀。以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清。 4.4.2免疫亲和柱净化 将免疫亲和柱连接于20mL玻璃针筒简上，取15mL滤液（相当于1g试样）加入玻璃针筒中，将空 气压力泵与针筒上端连接，使滤液以1mL/min的流速全部通过免疫亲和柱，再使少量空气通过柱体 以2X10ml水淋洗柱子，弃去全部流出液，再使少量空气通过柱体。加入1mL甲醇（4.2.2）进行洗 脱.洗脱速度1mL/min。洗脱液用HPLC级纯水定容至2.0mL,再用0.45μm滤膜过滤供高效液相 色谱测定。 4.4.3测定 4.4.3.1 色谱条件 色谱柱：Cl，150mmX4.6mm，5μm； 流动相：甲醇+水（45+55）； c) 流动相流速：0.8mL/min； d) 荧光检测器：激发波长360nm，发射波长425nm； e) 进样量：50叫L； 柱后衍生化系统： ---衍生溶液：0.05%碘溶液； -衍生溶液流速：0.2mL./min； 反应管温度.70℃； --反应时间：1min。 4.4.3.2色谱测定 根据样液中黄曲霉毒素B、B2、G1和G的含量，选定峰高相近的混合标准工作液，混合标准T.作 液和样液中黄曲霉毒素B1、B2、G和G2的响应值均应在仪器检测的线性范围内。对混合标准工作液 和样液按上述条件等体积参差进样，在上述色谱条件下，黄曲霉毒素B1、B、G，和G：衍生物的保留时 间分别约为9.30min、7.53min、6.62min、5.25min。标准品的液相色谱图参见附录A中图A.1。 4.4.4空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 4.5结果计算和表述 用数据处理装置或按式(1)计算试样中黄曲霉毒素（BI、B:、G1或G)的含量： ....( 1 ) As·m 式中： X——试样中黄曲霉毒素（B、Bz、G或G.)含量，单位为微克每于克（μg/kg）； A,"-样液中黄曲霉毒素（B、B2、G，或G）的峰高或峰面积，单位为毫米或平方毫米（mm或 mm); As--混合标准工作液中黄曲霉毒素（B:、B、G或Gz）的峰高或峰面积，单位为毫米或平方毫米 (mm或mm）； C"--混合标准工作液中黄曲霉毒素（B)、Bz、G或G2）的浓度，单位为微克每升（ug/L； V-样液最终定容体积.单位为毫升（ml）； 2 SN/T1736—2006 最终样液所代表的试样量，单位为克（g）。 注：计算结果扣除空白值。 5 测定低限、回收率 5.1 测定低限 本方法测定低限：黄曲霉毒素B、B:、G，和G，均为0.5ug/kg。 5.2 回收率 蜂蜜中黄曲霉毒素添加浓度及其回收率实验数据（见表1）。 表1实验数据 黄曲霉毒素 添加浓度/（μg/kg)） 回收率 B; 0. 5 90.2% Bi 1. 0 88.6% Bi 2. 0 92. 2K B3 5. 0 87.5% B 0, 5 85.3% B. 1. 0 88.6% B: 2. 0 91.7% B 90.1% 5. 0 GI 0. 5 87.2% Gt [. 0 86.8% (i) 2. 0 86.2% G) 5, 0 85.0% 0. 5 89.2% G: 1. 0 G, 2. 0 92.6% (i, 5. 0 90.5% 3 SN/T1736—2006 附 录A （资料性附录） 标准品色谱图 LU 3 黄曲霖毒素G; 5.5 5 黄曲霍毒素B1 黄曲霉毒素G? 4. 5 黄曲霉寿素B2 4 3. 5 3 2.5 6 8 10 12 0 2 r/min 4 图A.1 黄曲霉毒素B，、B2、G，和G2标准品的液相色谱图 SN/T1736—2006 Foreword Annex A of this standard is an informative annex This standard was proposed and managed by Certification and Accreditation Administration of the People's Republic of China. This standard was drafted byHenan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau. This standard is a professional standard for entry-exit inspection and quarantine promulgated for the first time.