SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1692.3—2006 非洲马瘟补体结合试验操作规程 Protocol of complement fixation test for african horse sickness 2006-04-25发布 2006-11-15实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伤 SN/T1692.3—2006 前言 SN/T1692共分为三个部分： 非洲马瘟琼脂免疫扩散试验操作规程； 非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程； 非洲马瘟补体结合试验操作规程。 本部分为SN/T1692的第3部分。 本部分的附录A为规范性附录。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：董俊、周晓黎、花群义、肖荣海、杨云庆、应雪松。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T1692.3—2006 非洲马瘟补体结合试验操作规程 1范围 SN/T1692的本部分规定了非洲马瘟补体结合试验的操作规程。 本部分适用于非洲马瘟的检验检疫。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T1692的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的 各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3试剂和材料 本部分所用水应符合GB/T6682中三级水的规格。所用试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 3.1非洲马瘟补反抗原：由指定单位提供或按附录A制备。 3.2补体：由指定单位提供或按附录A制备。 3.3溶血素：由指定单位提供。 3.4阳性血清：由指定单位提供，使用前1：2稀释，58℃～59℃水浴30min灭能。 3.5阴性血清：由指定单位提供，使用前1：10稀释，58℃~59℃水浴30min灭能。 3.6阿氏液：按附录A配制。 3.7 巴比妥缓冲液(VBS)：按附录A配制。 4 器械和设备 4.1 将各型滴头1.034×105Pa高压15min，烘干备用。 4.2冷冻高速离心机。 4.3水浴锅。 4.4微量移液器。 5样品处理 将待检动物编号登记后，无菌采血，5000r/min10℃离心10min～15min，无菌分离血清2份 一70℃保存（一份正式试验用，一份备用），使用前用巴比妥缓冲液作1：10稀释，马血清56℃、斑马血 清60℃、驴血清62℃水浴30min灭活。 6预备试验 6.12%绵羊红细胞悬液制备 6.1.1取盛有阿氏液100mL的灭菌烧瓶一个，从公绵羊颈静脉无菌采血50mL，混合后置4℃冰箱稳 定4d~5d。 6.1.2使用时将血液吸人离心管中，1500r/min离心15min，用吸管吸去上清和红细胞上层的白细胞 和血小板薄膜后加BBS缓冲液洗涤，再经1500r/min离心15min，弃去上清，如此反复洗四次。 6.1.3将最后一次洗过的红细胞泥用VBS缓冲液按2%稀释即成（2mL细胞+98mLVBS配制成 2%悬液)。 1 SN/T1692.3—2006 6.2.配制标准溶血管（见表1) 6.2.11.5%VBS溶血液制备：取7.85mL纯水加入0.15mL沉淀红细胞，混匀，使红细胞完全溶血 后，再加入5×VBS原液2mL。 6.2.21.5%红细胞悬液制备：取沉淀红细胞0.15mL，加人9.85mLVBS缓冲液工作液，混匀。 表1标准溶血管配制表 单位为毫升 溶血度/(%) 成分 80 90 100 0 10元 20 .30.. .40. 50 70 BBS缓冲液 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 1.5%BBS溶血液 0. 000 0.075 0.125 0.150 0.175 0.200 0,225 0. 250 0. 025 0.050 0.100 0.100 0.075 0. 050 0. 025 0.000 1.5%红细胞悬液 0.250 0.225 0.200 0.175 0.150 0.125 6.3溶血素效价测定 6.3.1 每批溶血素用前必须进行效价测定，并标明效价，30d内继续使用时，可不再测定。 稀释：先将溶血素作1：100稀释，即0.2mL(其中含甘油50%)溶血素加人9.8mLVBS缓冲 6.3.2 液，然后按表2配制不同稀释度溶血素。 表2溶血素稀释表 单位为毫升 稀释度 成 分 135004000 1 : 2 000 1:2500 *1T3000 1:4500 1 : 5000 1:100×溶血素 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0, 1 0, 1 BBS 1. 9| 2. 4 2. 9 3. 4 3.9 4. 4 4, 9 6.3.3 按表3建立试验，先将溶血素与红细胞混匀，再加人其他成分。 表3溶血素效价测定表 单位为毫升 管--号 1 3 44 15 6 7 O 9 10 成 分 溶血素 溶血素 溶血素 溶血素 溶血素 溶血素 溶血素 补体 缓冲液 稀释度 稀释度 稀释度 稀释度 稀释度 稀释度 稀释度 对照 对照 对照 1 : 2'0001 1:2500|1:30001:35001 1:40001 1:4500 1:5000 9. 1 溶血素 0, 1 0, 1 0. 1 0. 1 0. 1; 0. 1! 0. 1 2%红细胞 9. 1 0. 1 0.1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0.2 1:20补体 9. 2 0. 2 0. 2 0. 2 0. 2° 0. 2; 0. 2 BBS缓冲液 0,2 0: 2 0. 2* 0. 2 0. 2 0,2 0. 2 0. 4 0. 3 0. 5 *-37℃C 水浴 15 min 结果(例) 6.3.4判定：对比标准溶血管（见表1)进行 “+十十十”为不溶血。 6.3.4.2对照管出现如下结果时试验及判定结果成立：第8管溶血素对照管不溶血，第9管补体对照 管不溶血，第10管缓冲液对照管不溶血。 6.3.4.3能使绵羊红细胞发生完全溶血的溶血素最少量(最大稀释倍数)称为一个溶血素单位(即溶血 素的效价）。如表3所示结果（例）,该批溶血素效价为1：4000，即0.1mL1：4000稀释的溶血素含 一个溶血单位。 2 SN/T1692.3—2006 6.3.4.4溶血素工作液的配制：在本试验中使用二个溶血单位，溶血素工作液稀释度按溶血素效价的 2倍计算。 根据表3结果（例）,用BBS缓冲液将溶血素作1：2000稀释，即为溶血素工作液。 6.3.4.5致敏红细胞的制备：2%绵羊红细胞悬液加等量的二单位溶血素，充分混合后置37℃水浴 10min~15min即成，致敏红细胞置4℃冰箱内保存，可用7d。 6.4补体效价测定 6.4.1用BBS缓冲液将补体作1：20稀释。 6.4.2用BBS缓冲液将抗原作1：100稀释。 6.4.3按表4建立试验。 表4补体效价测定表 单位为毫升 管 台 成分 1 2 3 4 5 6 7 对照 1:20补体 0. 05 0. 08 0. 11 0.14 0.17 0.2 0. 23 BBS缓冲液 0. 35 0. 32 0. 29 0. 26 0. 23 0. 2 0. 17 0. 40 致敏红细胞 0. 2 0. 2 0. 2 0. 2 0. 2 0.2 0. 2 0, 2 37℃ 水浴 20 min 结果(例) ++++ ++ ++++ 6.4.4判定：对比标准溶血管（见表1)进行。 6.4.5表4中“-”为100%溶血，“+”为75%溶血，“++”为50%溶血，“+++”为25%溶血， “++++”为不溶血。 6.4.6当对照管出现不溶血时判定结果。 6.4.7以100%溶血的最小补体量为一个补体单位，表4结果（例)为0.14mL1：20补体。 6.4.8补体工作液配制：本试验使用二单位补体，先根据式(1)算出一单位补体稀释倍数再除2即得工 作液的稀释倍数。 20、 K : X 0. 2 ·(1 ) V 式中： K——单位补体稀释倍数； V-补体用量。 20 按表4中第5管为例：一 一单位稀释倍数= X0.2=28。 0.14 二单位补体稀释倍数为282=14，即(1：14稀释的0.2mL补体中含2单位补体。） 6.5抗原效价的确认或测定 6.5.1根据供应单位的抗原说明书来决定是否需要进行抗原效价的测定。如不需要测定，则按抗原说 明书稀释使用。 6.5.2如需测定，则按下列步骤进行。 6.5.2.1用VBS缓冲液将抗原依次作21~27稀释。 6.5.2.2用VBS缓冲液将阳性血清依次作212″稀释。 6.5.2.3用VBS缓冲液将阴性血清作1：2稀释。 6.5.2.4按表5建立试验。 6.5.2.5判定：对比标准溶血管（见表1)进行。 抗原效价。 3 SN/T1692.3—2006 6.5.2.7 以阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价。0.1mL该稀释度的 抗原为一个抗原单位，本试验使用4单位抗原。 表5非洲马瘟抗原测定表 单位为毫米 号 管 5 6 7 2 3 4 血清 抗原 补体 红细胞 成分 抗原 抗原 抗原 抗原 抗原 抗原 抗原 对照 对照 对照 对照 稀释度 稀释度 稀释度 稀释度 稀释度 稀释度 稀释度 1 : 16 1 :