SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1664—2005 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素 M1、B1、B2、G1、G2 含量的测定 Determination of aflatoxin M, ,B, ,B2,G, ,G2 content in milk and milk powder (ISO 14501:1998 Milk and milk powder- Determination of aflatoxin Mi content-- Clean-up by immunoaffiniy chromatography and by high-performance liquid chromatography, MOD) 2005-09-30发布 2006-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素 M,、B,、B2、G、G2含量的测定 SN/T1664—2005 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.bzcbs.com 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880×12301/16 印张1.75字数45千字 2006年1月第一版 2006年1月第一次印刷 印数1-2000 SN/T1664—2005 前 言 本标准修改采用ISO14501：1998《牛奶和奶粉—黄曲霉毒素M含量的测定 通过免疫亲和 色谱净化和高效液相色谱测定》（英文版）。 本标准根据ISO14501：1998重新起草。为了方便比较，在资料性附录A中列出了本标准条款和 国际标准条款的对照一览表。 由于本标准对免疫亲和柱的性能进行了测试，将其适用范围进行了扩展等，本标准在采用国际标准 时进行了相应的修改。这些技术性差异用垂直单线标识在它们所涉及的条款的页边空白处。在附录B 中给出了技术性差异及其原因的一览表以供参考。 为便于使用，本标准还做了下列编辑性修改： a) “本国际标准”一词改为“本标准”； b) 用小数点“，”代替作为小数点的逗号“，”； c) 删除国际标准的前言、附录和参考文献。 本标准的附录C、附录D为规范性附录，附录A、附录B、附录E为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国宁波出入境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人：李佐卿、康继韬、孙大为、章再婷、谢东华、俞雪钧。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T1664—2005 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素 M1、B1、B2、G1、G2 含量的测定 1范围 本标准规定了利用免疫亲和柱和高效液相色谱法测定牛奶、奶粉中黄曲霉毒素M1、BI、B2、GI、G2 含量的方法。 本标准适用于测定牛奶、奶粉中黄曲霉毒素M1、BI、B2、G1、G2的含量。本标准同样适用于低脂和 脱脂牛奶，低脂和脱脂奶粉。 对奶粉的最低检测限是0.08μg/kg，对牛奶的最低检测限是0.008μg/L。 2测定方法 2.1原理 试样通过免疫亲和柱时，黄曲霉毒素M、B、Bz、GI、G?被提取。特性抗体键合在亲和柱固体支持 物上，当样品通过亲和柱时，抗体选择性地与存在的黄曲毒素M、B,、Bz、G1、Gz（抗原）键合，形成抗 体-抗原复合体。停留在亲和柱上的样品中干扰基质用水淋洗掉。然后用洗脱液将亲和柱上的黄曲霉 毒素M1、BI、B2、G1、G2洗脱下来，收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪（HPLC)测定洗 脱液中黄曲霉毒素M1、Bi、Bz、Gi、G²含量。 2.2试剂和材料 除非特别注明，所用试剂均为分析纯；使用蒸馏水、去离子水或其他相当纯度的水。 2.2.1免疫亲和柱：免疫亲和柱应该含有黄曲霉毒素M1、BI、Bz、G1、G?的抗体。亲和柱的最大容量 不小于100ng黄曲霉毒素M、B、Bz、Gl、Gz（相当于50mL浓度为2μg/L的试样）、当标准溶液含有 4ng黄曲霉毒素M、B、Bz、GI、Gz（相当于50mL浓度为80ng/L的试样）时回收率不低于80%。任何 满足这些技术指标的免疫亲和柱均可采用。应该经常检查亲和柱的技术性能，对于每个批次的亲和柱 至少检查一次（见附录C)。 2.2.2正已烷。 2. 2. 3 三氟乙酸（>99%）。 2.2.4 异丙醇。 苯。 2.2.5 2.2.6 氮气。 2.2.7 乙：色谱级。 2.2.8 乙腈十异丙醇+水（8+12十80），流动相（使用前需要脱气混溶）。 2.2.9 10%乙腈溶液：将10mL的乙睛（2.2.7)加人90mL的水（使用前需要脱气）。 2. 2. 10 苯+乙腈（98+2)，用于配制黄曲霉毒素B、B2、G、G²标准溶液。 2.2. 11 苯+乙睛（9+1)，用于配制黄曲霉毒素MI标准溶液。 2.2.12次氯酸钠溶液（5%）：用于浸泡器血，去除黄曲霉毒素污染。 2.2.13黄曲霉毒素M1、BI、Bz、GI、G²标准溶液及标准曲线（见附录D)。 2.3仪器设备 使用实验室通用仪器设备，特殊情况说明如下： 1 SN/T1664-2005 2.3. 1 一次性注射器：10mL和50mL。 2.3.2 真空系统。 2.3.3 离心机：能产生6600r/min的转速。 2.3.4 移液管：1.0mL、2.0mL和50.0mL。 2.3.5 玻璃烧杯：250mL。 2.3.6 容量瓶：100ml。 2.3.7 水浴：能在30℃±2℃，50℃土2℃，35℃至37℃之间温度段使用。 2.3.8 滤纸。 2. 3. 9 有刻度的锥形玻璃试管：带玻璃磨口的瓶颈和瓶塞，容量为5mL、10mL、20ml。 2.3.10 高效液相色谱仪 2.3.10.1 无脉冲泵：可以调节到恒体积流量为1mL/min。 2.3.10.2 进样系统：具有固定进样量。 2.3.10.3 反相色谱柱：填充3μm或者5μm的十八烷基硅胶，加填充有反相材料的保护柱。 2.3.10.4 荧光检测器：激发波长365nm、发射波长435nm。 2.3.10.5 记录仪：带打印机或标绘器、或者电子积分仪、或者计算机数据处理系统。 2.3. 11 分光光度计。 2.3.12天平。 2.4试样制备 2.4.1牛奶 将牛奶样品在水浴（2.3.7)中加热到35℃～37℃。用滤纸（2.3.8)过滤，或者在6600r/min的条 件下离心15min，至少收集50mL的牛奶试样，然后按照2.4.4继续进行分析。 2.4.2奶粉 称取10g样品（精确到0.1g）置于250mL的烧杯中。将50mL已预热到50℃的水每次少量地加 人到奶粉中，用搅拌棒将其混合均匀。 如果奶粉不能完全地溶解，将烧杯在50℃的水浴（2.3.7)中加热30min，仔细混匀。 将牛奶乳浊液冷却至室温后，用少量的水将其全部转移到100mL的容量瓶（2.3.6)中，再用水稀 释至刻度。用滤纸（2.3.8)过滤，或者在6600r/min的条件下离心15min。至少收集50mL的牛奶试 样，然后按照2.4.4继续进行分析。 2.4.3免疫亲和柱的准备 将-次性的50mL注射器筒(2.3.1)与亲和柱(2.2.1)的顶部相连，再将亲和柱与真空系统连接起 来(2.3.2)。 2.4.4样品的提取、纯化与衍生 用移液管移取50mL的试样（2.4.1或2.4.2）到50mL的注射器筒（2.3.1）中，使它们以 2mL/min～3mL/min稳定的流速通过亲和柱，流速可以通过真空系统控制（2.3.2）。 取走50mL的注射器筒，并用干净的10mL注射器简代替。然后用10mL的水进行清洗，水的流 速应该保持稳定。清洗后，继续抽空气至亲和柱的下部完全干燥。 使亲和柱与真空系统脱离后，将4mL乙腈（2.2.7)加人到10mL的注射器筒简中将亲和柱上的黄曲 霉毒素M1、B,、B²、G1、G²洗脱下来。所有4mL乙腈通过亲和柱的时间至少需要60s，流速可以通过 注射器的柱塞来控制。将洗脱液收集于锥形试管中（2.3.9)。 将洗脱液同系列标准曲线工作液一样在氮气流（2.2.6）中挥发近干（如果蒸发至完全干燥，则会造 成黄曲霉毒素M1、B、Bz、G、G²的损失。）加入200μL正已烷（2.2.2）和200μL三氟乙酸（2.2.3），在 旋涡混匀器上混匀约5s~10s，让混合物在40℃水浴（2.3.7)中放置10min，然后在氮气流（2.2.6）下 再挥干，用0.5mL10%乙睛溶液（2.2.9)溶解，并在旋涡混匀器上充分混匀，供液相色谱用。 2 SN/T1664-2005 注：如果注入HPLC的含有黄曲霉毒素M，的样品中乙腈含量超过10%，色谱峰蜂变宽。如果水的含量超过90%，则 对色谱峰的形状没有影响。 2.5高效液相色谱测定 2.5.1测定条件 2.5.1.1泵 以恒定流速将流动相（2.2.8)通过HPLC柱。根据需要（根据所用色谱柱的型号），调整HPLC流 动相(2.2.8)中乙腈十异丙醇十水的比例，以保证使黄曲霉毒素M、BI、Bz、G1、G²与其他成分的分离 效果最佳。流动相(2.2.8)的流速根据所用色谱柱（2.3.10.3)的型号不同而有所差异。对于普通C1s 色谱柱（柱长约25cm、柱内径约4.6mm）而言，流速在1mL/min左右，效果最好；柱内径约3mm时， 流速在0.5mL/min左右，效果最好。 为了确定最佳的色谱条件，可以先将样品提取液（最好不含有黄曲霉毒素MI、Bi、Bz、Gi、G2）注入 HPLC,然后再注人提取液与黄曲霉毒素M,、RI、B。、G、G2标准溶液的混合液。