SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1615—2005/ISO 17410:2001 食品和动物饲料中嗜冷微生物计数方法 Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for the enumeration of psychrotrophic microorganisms (ISO 17410:2001,IDT) 2005-08-18发布 2006-02-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1615-2005/ISO17410:2001 前 言 本标准等同采用ISO17410：2001《食品和动物饲料微生物学-—-嗜冷微生物计数方法》（英文）。 为便于使用，本标准做了下列编辑性修改： “本国际标准一词改为‘本标准”。 a) b）用小数点“."代替作为小数点的遗号，。 c) 删除国际标准的前言。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：江志毅、杨相莹、李志培、张巨洲、苗丽。 本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T1615—2005/IS017410:2001 食品和动物饲料中嗜冷微生物计数方法 1范围 本标准规定了嗜冷微生物6.5℃菌落计数方法。 本标准适用于食品和动物饲料中嗜冷微生物的计数。 2规范性引用文件 下列引用标准中的条款通过本文的引用而成为本标准的条款。对于注明日期的引用标准，其后的 任何更改或修订版均不适用；然而，鼓励基于本标准的协议各方探讨使用下述引用标准最新版本的可能 性。对于未注明日期的引用标准，其最新版本是适用的。 ISO6887-1食品和动物饲料微生物学—微生物学检测样品的准备包括初始悬液和十倍稀释 液 第一部分：样品初始悬液和十倍稀释液的制备通则 ISO7218食品和动物饲料微生物学-— 微生物学检验通则 ISO8261牛奶和牛奶制品-—一微生物学检验样品的制备和稀释 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 曙冷微生物】 psychrotrophic microorganisms 在本标准特定条件下形成可计数菌落的细菌、霉菌和酵母菌。 4原理 品用规定量的试验样品初始悬液，为避免受热力影响，采用表面接种。在相同条件下，每一稀释度试验 样品分别接种两个琼脂平板。 4.2将平皿放入6.5℃培养箱中有氧培养10d。 4.3以从琼脂平板上获得的菌落数来计算每毫升或每克样品中的微生物数量。 5培养基和稀释液 现行的实验室操作，可按ISO7218进行。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯级，水为蒸馏水，去离子水或纯净水。如果已准备好的培养基 前提下储藏期不超过一个月。 5.1稀释液 见ISO6887-1。 5.2平板计数琼脂(PCA) 5.2.1成分 5. 0 g 蛋白陈 1 SN/T1615—2005/IS017410:2001 2.5 g 酵母浸膏 1. 0 g 葡萄糖 琼脂 9 g~18 gl) 水 1 000 mL 做奶制品检测时，建议每升培养基中加入1.0g脱脂奶粉，此奶粉中不应含有抑菌物质。 5.2.2制备 用水溶解各成分或脱水合成培养基，必要时可加热。彻底搅拌均匀后静置数分钟。必要时调整 pH值（6.9)，使灭菌后的培养基在25℃时pH值为7.0±0.2。 将适量的培养基装人三角烧瓶或瓶子中（6.10），放人高压灭菌器中（6.1)121℃灭菌15min。 如果培养基需要立即使用，用之前可将其放入44℃～47℃水浴箱中（6.7)冷却。否则，允许将培养 基凝固在三角烧瓶或瓶子中。使用之前将其放在沸水中使培养基完全融化，再放入44℃～47℃水浴箱 (6.7)冷却。 每个培养皿中（6.5)加入大约15mL已制备好的培养基，凝固后使用。 在使用刚制备好的琼脂平板之前，先仔细将其表面干燥（合适的做法是打开平皿盖，琼脂表面朝 下），放人37℃～55℃的培养箱内（6.3)直到琼脂表面于燥，也可将培养血半开盖放置在层流安全柜中 30min或加盖过夜。 6仪器和玻璃器血 通用要求见ISO7218。 玻璃器血可选择相似规格，微生物实验室设备要求如下。 6.1高压灭菌器：可操作温度为121℃。 6.2干热灭菌器：可操作温度在170℃～175℃，时间为1h。 6.3培养箱：可操作温度为37℃~55℃。 6.4培养箱：可操作温度为6.5℃士1℃。 6.5培养血：玻璃或塑料制品均可使用，直径约为90mm~100mm。 6.6 吸管：经过校准的有微量刻度的吸管，0.1mL、1mL和10mL。 6.7水浴箱：或类似装置，其中一个可操作温度为44℃～47℃，另一个可以把水煮沸。 6.8 菌落计数仪：由一个发光基座和一个机械或电子数字计数器组成。 6.9pH计：在25℃时pH计的读数值应最接近0.01pH单位，使测量结果能精确到士0.1pH单位。 6.10 0瓶子或三角烧瓶：选取合适的容量，用于制备、灭菌和贮存（必要时）培养基。 6.11玻璃或塑料涂抹棒：经灭菌后，用于涂抹培养基表面的接种物。 7采样 实验室所接受样品应具有产品的真实代表性并且在运输和储藏期间不得损坏或改变，这一点很 重要。 采样不是本标准规定方法的组成部分，相关产品的处理参见具体的国际标准。如果没有具体的国 际标准，推荐使用相关团体根据本标准所达成的协议。 8试验样品的制备 试验样品的制备按照ISO6887-1或ISO8261（奶制品）的要求进行。 1）根据琼脂凝胶的强度而定。 2 SN/T1615—2005/ISO17410:2001 9程序 9.1初始悬液和稀释 初始悬液（初次稀释）和进一步的稀释按照ISO6887-1或ISO8261（奶制品）进行。 9.2接种和培养 9.2.1试验样品（如果是液体)或其他产品的初始悬液及其每一个稀释度悬液需各接种两个平板计数 琼脂，用灭菌吸管(6.6)吸取0.1mL液体加到相应每一个做有标记的平板计数琼脂(PCA)平血中央。 9.2.2用已灭菌的涂抹棒(6.11)小心地将琼脂平板表面的接种物尽可能快地涂抹均勾，注意不要接触 到平血边缘，直到琼脂表面不再有可见的液体为止，一个涂抹棒只涂一个平血，不得重复使用。应设一 个不含接种物的琼脂平板做为对照，以检查灭菌情况。 为了使稀释悬液含有最大数量的试验材料，一个样品的所有稀释液从最高稀释度到最低稀释度可 以使用同一个涂抹棒操作。 9.2.3将接种好的琼脂平板（9.2.2)倒置放入6.5℃培养箱中(6.4)，培养10d。 9.3计数 15个～150个为合适的计数范围。重要的是针尖样的菌落应计数在内，但应注意与平板内未溶解微粒 或沉淀物质的区别，避免误判。 蔓延生长的菌落应视为单个菌落，如果蔓延生长菌落的面积小于整个培养血的四分之一，计数其余 未受影响部分的菌落数，以此代表整个培养血的菌落数。如果培养血有四分之一以上的面积被蔓延生 长菌落覆盖，放弃对该琼脂平板的计数。 10结果计算与表述 10.1计算 一般情况下个琼脂平板上的菌落数至少不少于15个。 计算每克或每毫升样品中嗜冷微生物菌落数(CFU)N，使用式(1)计算： EC ....( 1 ) 式中： ZC-两个连续稀释度的所有琼脂平板上菌落数的和，每一个琼脂平板上的菌落数不少于 15个； V-一每一个琼脂平板上的样品悬液的实际接种量，单位为毫升（mL）； 第一稀释度琼脂平板的数量； n n2———第二稀释度琼脂平板的数量； d—第一稀释悬液的稀释倍数。 注；最低稀释度悬液是含试验样品最多的悬液 10.2结果表述 10.2.1一般情况 琼脂平板上的菌落数在15个至150个之间。 结果保留两位有效数字，第三位数字以四舍五入方法计算。例如：28500修约为29000，11500修 约为12000。 每毫升（液体产品）或每克（其他产品）样品中嗜冷微生物菌落数(CFU)最好用数字1.0～9.9乘以 10的幂来表示。 SN/T1615—2005/ISO17410:2001 10.2.2低数值的估算 如果试验样品（液体产品）或初始悬液（其他产品）的两个琼脂平板上的菌落数均小于15个，计算两 个琼脂平板上菌落数的算术平均数。 结果表示如下： 每毫升（液体产品）或每克（其他产品）试验样品中嗜冷微生物菌落数的估算值为Ne。 Ne的采用式(2)计算： Ec ...(2) 式中： ZC-—两个琼脂平板上菌落数的和； V- 每一个琼脂平板上样品悬液的实际接种量，单位为毫升（mL）； -琼脂平板的数量(本例n=2)； d——样品初始悬液或实际接种悬液的稀释倍数。 10.2.3无菌落出现 如果与试验样品一致的两个琼脂平板均无菌落出现，报告结果如下： 每毫升（液体产品)或每克(其他产品）中嗜冷微生物数量小于1/(V·d)； 10.2.4大数值的估算 如果只有琼脂平板上菌落数大于150的这种情况，计数最接近150个菌落数的琼脂平板上的菌落 并计算出算术平均数。 结果用式(3)计算： Zc ·(3) (VxnXd) 式中： N' 每毫升或每克样品中嗜冷微生物菌落数的估计值， ZC- 两个琼脂平板上菌落数之和； V- 每一个琼脂平板上样品悬液的实际接种量，单位为毫升（mL）； 琼脂平板的数量（本例n=2)： n- d-一与样品悬液相一致的稀释倍数。 10.3计算举例 试验样品接种量0.1mL，嗜冷微生物计数结果如下： 接种10-²稀释度悬液，两个琼脂平板上的菌落数分别是138和125； -接种10-3稀释度悬液，两个琼脂平板上的菌落数分别是20和18； 138