ICS 71. 080. 99 G 15 HG 备案号：50892—2015 中华人民共和国化工行业标准 HG/T 4850.3—2015 稳定性同位素氙标记试剂 第3部分：恩诺沙星-D5 Stable isotope deuterium labelled reagents Part3:Enrofloxacin-D5 2015-07-29发布 2016-01-01实施 中华人民共和国工业和信息化部发布 HG/T4850.3—2015 前 言 HG/T4850《稳定性同位素尔标记试剂》分为3个部分 第1部分：甲萘威-D； 第2部分：沙丁胺醇-D:； 第3部分：恩诺沙星-D；。 本部分为HG/T4850的第3部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由中国石油和化学工业联合会提出， 本部分由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会（SAC/TC105）归口。 本部分起草单位：上海化T研究院、上海稳定性同位素T程技术研究中心。 本部分主要起草人：宋明鸣、杜晓宁、郑波、孙雯、雷雯、蔡银萍。 (23) HG/T4850.3—2015 稳定性同位素氛标记试剂 第3部分：恩诺沙星-D5 1范围 HG/T4850的本部分规定了稳定性同位素氛标记试剂恩诺沙星-D,的要求，试验方法，检验规 则，标识，包装、运输和贮存。 本部分适用于以碘乙烷-D；和环丙沙星为原料、通过有机合成法制备的稳定性同位素氛标记恩诺 沙星-D产品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T8170一2008数值修约规则与极限数值的表示和判定 3分子结构式 D,C CD 4符号 下列符号适用于本文件。 "A：同位素原子，其中A表示元素符号．m表示该元素的同位素的相对原子质量数。例如："H 表示氢元素中相对原子质量数为2的同位素氢原子，通常以D表示。 "A，：同位素原子标记个数，其中A表示元素符号m表示该元素的同位素的相对原子质量数， n表示含该元素的同位素原子的个数。例如："H，表示氢元素中相对原子质量数为2的同位素氢原子有 5个，通常以D，表示。 atom%"A：同位素丰度的单位，表示A元素的相对原子质量数为m的原子占A元素的原子百 分数。例如：alom%D表示相对原子质量数为2的同位素氢原子在氢元素中所占的原子百分数。 5要求 5.1外观 白色或微黄色粉末。 5.2 技术指标 产品的技术指标应符合表1的要求。 (25) HG/T4850.3—2015 表1 产品技术指标 指 标 项 日 优级品 合格品 纯度（质量分数）/% 99. 0 98.0 D同位素丰度/(atom%D) 99. 0 97. 0 6试验方法 除非另有规定，本部分分析过程中所用水应符合GB/T6682规定的一级水，试剂均为优级纯。 6.1外观 目视检验。 6.2纯度—高效液相色谱法 6.2.1方法原理 高效液相色谱法测定恩诺沙星-D，的纯度，以天然丰度恩诺沙星标准品作为外标建立标准工作曲 线，测定稳定性同位素标记恩诺沙星-D的纯度 6.2.2试剂和材料 6.2.2.1 乙腈：色谱纯。 6.2. 2.2 恩诺沙星标准品：纯度≥99%。 6.2. 2. 3 磷酸：分析纯。 6.2. 2.4 三乙胺：分析纯。 6.2.2.5 磷酸盐水溶液：0.02mol/L。 称取0.98g磷酸于烧杯中.加人500mL水，搅匀，用三乙胺调节pH至2.94.经0.45μm滤膜 过滤， 超声30min，待用。 6. 2. 3 仪器和设备 6. 2. 3. 1 通常实验室用玻璃仪器及设备。 6. 2. 3. 2 涡旋混合器。 6. 2. 3. 3 液相色谱仪：配紫外检测器或PDA阵列检测器。 6.2.3. 4 微量进样器：25μL。 6. 2. 3.5 分析天平：精度十万分之一。 6.2. 3.6 微孔滤膜：孔径0.22um。 6.2. 3.7 超声波脱气仪。 6.2.4 色谱条件 推荐的色谱条件如下，也可选择其他达到同等分离效果的条件。 色谱柱：AthenaWP-C18，150mmX4.6mm1.D.，5μm，或相当者； 柱温：30℃； 进样量：20uL； UV检测器波长：278nm； 流速：1.0mL/min; 流动相：A为乙睛，B为0.02mol/L磷酸盐水溶液； 洗脱条件：A/B=70/30，等度洗脱。 6.2.5分析步骤 6.2.5.1外标标准储备溶液的制备 2 (26) HG/T4850.3—2015 称取12.5mg（精确到0.01mg）恩诺沙星标准品，溶于乙睛，转移至25ml容量瓶中定容，得 到浓度为500mg/L的标准储备溶液，避光保存于冰箱中，可使用3个月。 6.2.5.2外标标准工作溶液的制备 将上述标准储备溶液用乙睛稀释得到浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、 15.0mg/L和50.0mg/l.的标准T.作溶液，避光保存于冰箱中，可使用1个月。 6.2.5.3试样的溶解 做两份试料的平行测定。每份称取12.5mg（精确到0.01mg）恩诺沙星-Ds，溶于乙腈，定容于 25mL容量瓶中，得到浓度为500mg/L的样品储备溶液。用乙腈稀释样品储备溶液得到浓度为 5mg/L的样品分析液。 6.2.5.4标准工作曲线的建立 待高效液相色谱仪稳定后，将6.2.5.2得到的系列标准T.作溶液用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤 后，用微量进样器分别注入仪器。每个浓度的标准工作溶液均重复测定3次，以标准工作溶液的浓度 为横坐标、每个浓度3次重复测定得到的外标物峰面积平均值为纵坐标绘制标准工作曲线。 6.2.5.5试样的测定 将6.2.5.3得到的试料溶液用孔径0.22um的微孔滤膜过滤后，用微量进样器注人仪器，每份试 料溶液重复进样测定3次，计算得出3次测定的峰面积平均值，由标准曲线方程求得试料溶液的浓 度，代人公式（1）可得试样的纯度。 6.2.6分析结果的计算与表述 6.2.6.1纯度 纯度w以质量分数计，数值以%表示，按公式（1）计算： w=k (1) in 式中： k一一稳定同位素D标记恩诺沙星与恩诺沙星标准品的质量校正系数：1.01； 一试样峰面积平均值在标准工作曲线上对应的产品溶液的浓度的数值，单位为毫克每升 (mg/L); V----试料溶液的定容体积的数值，单位为升（L)； XST一一恩诺沙星标准品标注纯度的数值，以质量分数表示； 试样的质量的数值，单位为毫克（mg）。 m 计算结果保留到小数点后1位。取平行测定结果的算术平均值为测定结果。 6.2.6.2允许差 平行测定结果的绝对差值≤0.5%。 6.3D同位素丰度——液相色谱-质谱法 6.3.1方法原理 将样品用无水甲醇溶解，引人液相色谱-质谱的电喷雾离子源（ESI），使样品溶液发生静电喷雾， 在近大气压下的干燥气流中形成带电雾滴。随着溶剂蒸发，通过离子蒸发等机制形成气态离子，进入 质谱分析。按离子的质荷比（m/）不同加以分离，最终被离子收集检测器采集到相应的质谱信息。 经计算、校正后输出各m/峰强度，用“质量簇”分类法计算试样恩诺沙星-D,的D同位素丰度值。 “质量簇”分类法原理参见附录A。 6.3.2试剂和材料 6.3.2.1无水甲醇：色谱纯。 6.3.2.2离心管：1.5mL。 6.3.3仪器和设备 (27) 3 HG/T4850.3—2015 6.3.3.1通常实验室用玻璃仪器及设备。 6.3.3.2液相色谱-质谱联用仪。 6.3.3.3 3进样针：0.50mL。 6.3.3.4螨动泵。 6.3.4质谱条件 电喷雾电压：3.5kV； 调谐滤镜电压：70V； 离子传输管温度：275℃； 雾化气流量：12L/min； 单次质谱扫描时间：0.5s； 质谱谱图叠加次数：>20； 扫描模式：正离子模式； 扫描范围：m/==[M+H]+±10dalton; 蠕动泵流速：5μL/min。 6.3.5分析步骤 6.3.5.1试样的溶解 做两份试料的平行测定。取少量试样，置于1.5mL离心管中，加人1mL无水甲醇，充分溶解， 浓度约为10mg/L.。 6.3.5.2试样的测定 将6.3.5.1得到的试料溶液，吸人进样针，连接到质谱仪进样系统，待仪器真空度低于2×10 Pa后利用动泵将进样针内的溶液推入质谱仪离子源，采集正离子模式扫描的m/=360～365的信 号峰，输出相应的信号峰强度数据。通过公式计算得到试样的D同位素丰度。 6.3.6分析结果的计算与表述 6.3.6.1不同D标记度的摩尔分数计算 采集质谱图中m/=360、361、362、363、364、365的峰强度数据，代入方程组（2）计算，解 得rlabj（j=0.1,2,3，4,5）。 [A36 =r lab: X0. 799 A361=.r labnX0.176+.rlabl X0.799 A362=.r laboX0.023+.r lablX0.176+. lab2X0.799 A36s=rlabX0.002+.rlablX0.023+.rlab2X0.176+.r lab3X0.799 ..... (2) A364=.rlab1 X0.002+lab2 X0.023+laba X0.176+rlab+X0.799 A365=.r lab2X0.002+.rlab3X0.023+r"labX0.176+.rlab:X0.799 [." labo +.r"lab1 +.r"