ICS65.150 CCSB52 NXSLT 宁夏饲料工业协会团体标准 T/NXSLT0303—2025 黄河鲶微卫星亲子鉴定技术规程 Technicalregulationsformicrosatellite-basedparentageidentificationofLanzhou Catfish （报批稿） 在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。 2025-07-01发布 2025-08-01实施 宁夏饲料工业协会  发布 全国团体标准信息平台 T/NXSLT0303—2025 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由宁夏大学提出。 本文件由宁夏饲料工业协会归口。 本文件起草单位：宁夏大学、宁夏水产研究所（有限公司）。 本文件主要起草人：李兰兰、连总强、张娟、赵红雪、肖伟、赛清云、刘彦斌、赵文凯。 全国团体标准信息平台 T/NXSLT0303—2025 1黄河鲶微卫星亲子鉴定技术规程 1.范围 本标准规定了黄河鲶家系构建、基因组DNA的提取及优化、微卫星多重PCR的组建 及优化以及微卫星多重PCR的鉴定与应用技术。 本标准适用于黄河鲶的亲子鉴定。 2.规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日 期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包 括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T34748-2017《水生动物核酸提取纯化方法》 GB/T35890-2018《实验动物微卫星DNA检测方法》 SC/T1137-2021《鱼类种质鉴定微卫星分子标记法》 SC/T7223-2023《水产动物亲子鉴定技术规范微卫星DNA标记法》 3.术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 4.黄河鲶家系构建 4.1亲鱼选择 黄河鲶亲鱼为宁夏水产研究所人工养殖的商品鱼群体。所选亲鱼均为3-4龄性成熟个体， 体重范围0.5-1.5kg/尾。亲鱼培育采用鲇鱼主养模式，具体养殖参数为：放养密度1000-1500 kg/hm²，雌雄配比1.5:1。 4.2人工催产 在5～7月繁殖期，选择健康、性腺发育良好的亲鱼，雄性体重1.0～1.5kg/尾，雌性0.5～ 1.0kg/尾。催产所用药物为注射用多潘立酮（DOM）和注射用促黄体素释放激素A2 （LHRH-A2），雌性亲鱼注射量为（DOM3mg+LHRH-A25μg）/kg,雄性亲鱼减半。水 温控制在20～22℃，效应时间12～14h。 4.3组建家系 每个家系选择1雌+1雄，轻压雌鱼腹部收集卵子，用无菌注射器吸取雄鱼精液，将精 液滴入卵子中，加入池塘水激活精液，反复缓慢搅动，使得精卵充分结合。将受精卵均匀 地铺在附卵片上，移入静水中充气孵化，孵化后的仔鱼移入新池，并设置家系的编号。 5.基因组DNA提取及优化 5.1采集样品 全国团体标准信息平台 T/NXSLT0303—2025 2随机已建立的3个家系（编号为7-1、8-8和8-11），每个家系随机选取30尾子代，候选 亲本样本由6尾真正亲本和14尾（雌、雄各7尾）非亲本组成，另从7-1中随机选取18尾，8-8、 8-11中随机各选取16尾共50尾子代用于双盲试验。此外，随机选取16尾黄河鲶养殖群体用 于构建黄河鲶微卫星多重PCR体系。所有样本均采集尾鳍组织，用75%无水乙醇固定后置 于-80℃冰箱中保存备用。 5.2基因组DNA提取及纯化 （1）消化：剪取20mg左右尾鳍样品，晾干后置于1.5ml离心管中尽量剪碎，分别加 入350μL的组织裂解液和8μL（20mg/ml）的蛋白酶K，充分混匀，于56°C水浴锅中消化3~5 h，直至组织完全消化澄清。 （2）抽提：消化结束后加入1/5体积（约70μL）3mol/LNaAc和等体积（约500μL） 的Tris平衡苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），颠倒混匀5min，12000r/min离心10min，取 上清液200~300μL移至另一离心管中。 （3）纯化：按照DNA产物纯化试剂盒的方法对抽提产物进一步纯化，得到高纯度的 DNA。 已提取的黄河鲶基因组DNA经超微量核酸分析仪检测浓度及OD值，同时1%琼脂糖凝 胶电泳检测DNA的完整性。将合格的DNA用ddH2O稀释至50ng/µL，−20°C保存备用。 6.微卫星多重PCR的组建及优化 6.1微卫星的筛选 根据微卫星位点的多态性（多态性应大于等于0.5）、序列重复单位及扩增效果等，从 已开发的黄河鲶微卫星中筛选出18个位点。将每对引物的信息通过MultiplexManager1.0 软件模拟检测，避免产生错配、引物二聚体和发卡结构等。 6.2微卫星多重PCR的组合原则 先进行两个位点之间的组合，然后在扩增效果较好的2重PCR体系中添加另一对引物筛 选3重PCR体系，以此类推。以16尾黄河鲶个体DNA为模板构建多重PCR体系，通过引物浓 度、退火温度和延伸时间等因素优化筛选最佳扩增条件，3%琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR 扩增效果。 6.3PCR反应体系优化 PCR反应总体积20µL，包括DNA1µL（约50ng），Premix2×Taq10µL，正反向引物 各0.5µL（10pmol/µL），加ddH2O至总体积20µL。PCR反应程序:94℃预变性3min，94℃ 变性1min，50~60℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环；再72℃延伸10min。PCR扩增 后经3%琼脂糖凝胶电泳检测后将其产物进行毛细管电泳ABI3730XL全自动STR测序分析。 7.微卫星多重PCR的鉴定与应用技术 7.1微卫星多重PCR建立 PCR扩增后经3%琼脂糖凝胶电泳检测后将其产物进行毛细管电泳ABI3730XL全自动 STR测序分析。本技术规程通过不同组合扩增，最终选取14个微卫星位点科学设计优化确 定了2组三重PCR和2组四重PCR。 7.2亲权分析 全国团体标准信息平台 T/NXSLT0303—2025 3采用GeneMarker软件读取等位基因值；采用χ2检验家系中各位点的分离模式是否满 足孟德尔遗传定律（AB×AC=1:1，AB×AB=1:2:1和AB×CD=1:1:1:1），显著性水平设 置为P<0.01；用CervusV.3.0软件进行亲子鉴定分析，具体参数包括等位基因数（Na）、 有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农信息指数（I）、无 效等位基因频率（F(Null)）以及多态信息含量（PIC），计算各位点的平均排除概率（EP）、 累积排除概率（CEP）、模拟鉴定率及实际鉴定率（置信区间为95%）。 7.3聚类分析 利用软件GenAlex6计算110尾个体和50尾双盲子代的遗传距离，采用MEGA7.0软件构 建系统进化树。 全国团体标准信息平台