ICS 65.120 CCS B 46 团体 标准 宠物配合饲料中 8种水溶性维生素的测定 液相色谱－串联质谱法 Determination of 8 water -soluble vitamins in pet feeds — Liquid chromatography －tandem mass spectrometry 2024 -09-23发布 2024 -10-19实施 中国饲料工业协会 发 布 T/CFIAS 6012—2024 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6012—2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国饲料工业协会团体标准技术委员会提出并归口。 本文件起草单位： 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、北京市兽药饲料监测中心、 健 合（中国）有限公司、 上海天祥质量技术服务有限公司、天津雀巢普瑞纳宠物食品有限公司 、乖宝宠物 食品集团股份有限公司、深圳红瑞生物科技有限公司、皇誉宠物食品（上海）有限公司、上海宠幸宠物 用品有限公司 。 本文件主要起草人： 严华、李兰、樊霞、贾铮、 王继彤、 姚婷、刘晓露、 赵玲玲、张益乐、边涛、 陈莉莉、薛德时、马海建、朱逸、周淼佳、田天、杨文瀚、秦华、徐法典、胡玉珍、田甜、陈姝、谢爽、 吕少骏、刘淑琴、徐思远、田静 、娄迎霞、李征、曹林、冯秀燕 。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6012—2024 1 宠物配合饲料中 8种水溶性维生素的测定 液相色谱－串联质谱法 1 范围 本文件描述了宠物配合饲料中 8种水溶性维生素的液相色谱 -串联质谱测定方法。 本文件适用于固态宠物配合饲料中维生素 B1、维生素 B2、烟酸、烟酰胺、 D-泛酸、维生素 B6、D-生物 素和叶酸的测定。 本文件方法定量限为 0.2 mg/kg 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的水溶性维生素在酸性条件下提取，用液相色谱 -串联质谱仪测定，烟酰胺和叶酸用内标法 定量，其余 6种水溶性维生素用外标法定量 。 5 试剂或材料 除另有说明外，所用试剂均为 分析纯。 5.1 水：GB/T 6682 ，一级。 5.2 甲酸：色谱纯。 5.3 乙腈：色谱纯。 5.4 甲醇：色谱纯。 5.5 盐酸溶液Ⅰ：量取 8.3 mL盐酸，用水稀释至 1 000 mL ，混匀。 5.6 盐酸溶液Ⅱ：移取 5 mL盐酸，用水稀释至 500 mL，混匀。 5.7 氨水溶液：移取 10 mL氨水，用水稀释至 100 mL，混匀。 5.8 碳酸钠溶液：称取 1.06 g碳酸钠，加水溶解并稀释至 100 mL，混匀。 5.9 甲酸溶液：取 1 mL甲酸（5.2），用水稀释至 1 000 mL ，混匀。 5.10 甲酸乙腈溶液：取 1 mL甲酸（5.2），用乙腈（ 5.3）稀释至 1 000 mL ，混匀。 警示：5.11-5.19操作应避免强光照射。 5.11 维生素B1（硝酸硫胺）、维生素 B2、烟酸、烟酰胺、 D-泛酸钙、维生素 B6（盐酸吡哆醇）、 D-生 物素、叶酸、烟酰胺 -D4、叶酸-D4标准品信息见附录 A。 5.12 维生素B1标准储备溶液（ 1 mg/mL）：精确称取硝酸硫铵（以硫铵素计）适量（精确到 0.01 mg）， 置于棕色容量瓶，用盐酸溶液Ⅰ（ 5.5）溶解并定容，混匀。 2 ℃～8 ℃避光保存，有效期 6个月。 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6012—2024 2 5.13 维生素B2标准储备溶液（ 0.1 mg/mL ）：精确称取维生素 B2适量（精确到 0.01 mg），置于棕色 容量瓶，用 1 mL盐酸超声溶解后，用水定容，混匀。 2 ℃～8 ℃避光保存，有效期 6个月。 5.14 叶酸标准储备溶液（ 1 mg/mL）：精确称取叶酸适量（精确到 0.01 mg），置于棕色容量瓶，用碳 酸钠溶液（ 5.8）溶解并定容，混匀。 2 ℃～8 ℃避光保存，有效期 6个月。 5.15 烟酸、烟酰胺、维生素 B6、D-泛酸钙、 D-生物素标准储备溶液（ 1 mg/mL）：精确称取烟酸、烟 酰胺、维生素 B6（以吡哆醇计）、 D-泛酸钙（以 D-泛酸计）、 D-生物素各适量（精确到 0.01 mg），分 别置于棕色容量瓶，用甲醇（ 5.4）溶解并定容，混匀。 2 ℃～8 ℃避光保存，有效期 6个月。 5.16 混合标准中间溶液（ 10 µg/mL）：分别移取适量的标准储备溶液（ 5.12，5.13，5.14，5.15）， 用水定容，混匀。 2 ℃～8 ℃避光保存，有效期 1个月。 5.17 内标储备溶液（ 0.1 mg/mL ）：精确称取烟酰胺 -D4和叶酸-D4各适量（精确至 0.1 mg），分别置 于棕色容量瓶中，烟酰胺 -D4用甲醇（ 5.4）溶解并定容，混匀；叶酸 -D4用碳酸钠溶液（ 5.8）溶解并定 容，混匀。 2 ℃～8 ℃避光保存，有效期 6个月。 5.18 内标混合溶液（ 10 µg/mL）：准确移取一定体积的内标储备溶液（ 5.17）于棕色容量瓶中，用水 定容，混匀。 2 ℃～8 ℃避光保存，有效期 1个月。 5.19 混合标准系列溶液：准确量取混合标准中间溶液（ 5.16）和内标混合溶液（ 5.18）适量，用水配 成浓度为 5 ng/mL、10 ng/mL 、50 ng/mL 、100 ng/mL 、500 ng/mL 、1 000 ng/mL 和2 000 ng/mL ，内 标浓度均为 20 ng/mL 的标准系列溶液。临用现配。 5.20 微孔滤膜： 0.22 mm。 6 仪器设备 6.1 液相色谱 -串联质谱仪：配电喷雾离子源（ ESI）。 6.2 分析天平：精度为 0.1 mg和0.01 mg。 6.3 酸度计：精度为± 0.01。 6.4 涡旋混合器。 6.5 超声波清洗仪。 6.6 恒温水浴锅：控温精度为 1 ℃。 7 样品 按GB/T 20195 制备试样，至少 200 g，粉碎使其全部通过 0.425 mm 孔径的分析筛，充分混匀，密闭 容器中避光保存，备用。 8 试验步骤 警示：以下操作应避免强光照射。 8.1 试样溶液制备 平行做两份试验。 称取试样 1 g（精确至 0.1 mg）于50 mL离心管中， 加入 100 mL内标混合溶液 （ 5.18）， 加入20 mL盐酸溶液Ⅱ（ 5.6），涡旋 1 min，将离心管置于 50 ℃水浴中加热 40 min（中间旋摇两次）， 冷却至室温，用氨水溶液（ 5.7）调节pH值至6.0，用水转移至 50 mL容量瓶中，定容，摇匀。静置，取 上清液微孔滤膜（ 5.20）过滤，待测。 8.2 仪器参考条件 8.2.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6012—2024 3 a) 色谱柱： C18色谱柱（用极性小分子封端），柱长 100 mm，内径2.1 mm，粒径3.0 μm，或性 能相当者； b) 流动相： A——甲酸溶液（ 5.9），B——甲酸乙腈溶液（ 5.10）； c) 梯度洗脱：梯度洗脱程序见表 1； d) 流速：0.30 mL/min ； e) 柱温：25 ℃； f) 进样量： 2 L。 表1 梯度洗脱程序 时间/min A/% B/% 0.01 95 5 1.0 95 5 3.0 80 20 7.0 10 90 9.0 10 90 9.1 95 5 12.0 95 5 8.2.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ ESI+）； b) 检测方式：多反应监测（ MRM）； c) 喷雾电压： 5.5 kV； d) 离子源温度： 500 ℃； e) 雾化气流速： 50 L/min ； f) 辅助气流速： 50 L/min ； g) 气帘气流速： 20 L/min ； h) 雾化气、辅助气、气帘气、碰撞气为高纯氮气； i) 监测离子对、碰撞能量和去簇电压见表 2。 表2 水溶性维生素及其内标的监测离子对、碰撞能量和去簇电压参考值 待测物名称 母离子（ m/z） 子离子（m/z） 碰撞能量 /eV 去簇电压 /V 维生素B1 265.0 122.3a 18.7 60 144.2 15.0 维生素B2 377.0 242.8a 30.0 100 198.0 46.8