书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜３ １ ３ ２—２ ０ １ ２ 出口牛乳制品中牛免疫球蛋白 犌的测定 酶联免疫吸附法 犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犫 狅 狏 犻 狀 犲 犻 犿犿 狌 狀 狅 犵犾 狅 犫 狌 犾 犻 狀犌犻 狀犿 犻 犾 犽 狆狉 狅 犱 狌 犮 狋 狊狅 犳犲 狓 狆狅 狉 狋— 犈 狀 狕狔犿 犲  犾 犻 狀 犽 犲 犱犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋犪 狊 狊 犪 狔犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ２０ ５０ ７发布 ２ ０ １ ２１ １１ ６实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、北京望尔生物技术有限公司 。 本标准主要起草人 ：石建平、高东微、孟日增、马孝斌、刘津、万宇平、何方洋、陈源树。 Ⅰ犛 犖／犜３ １ ３ ２—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.出口牛乳制品中牛免疫球蛋白 犌的测定 酶联免疫吸附法 １　范围 本标准规定了牛乳制品中牛免疫球蛋白 Ｇ含量的酶联免疫吸附试验检测方法 。 本标准适用于牛初乳产品和添加了牛初乳成分的牛乳制品中的牛免疫球蛋白 Ｇ含量的测定 。 本标准的测定低限为 ９． ８ｍｇ／ｇ。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　原理 采用间接竞争酶联免疫吸附方法 ，在微孔条上包被牛免疫球蛋白 Ｇ抗原，试样中牛免疫球蛋白 Ｇ 与酶标板上的包被抗原竞争抗牛免疫球蛋白 Ｇ抗体，加酶标记抗抗体后 ，显色剂显色 ，终止液终止反 应。用酶标仪在 ４ ５ ０ｎ ｍ 处测定吸光度 。吸光值与牛免疫球蛋白 Ｇ含量成负相关 ，与标准曲线比较即 可得出牛免疫球蛋白 Ｇ含量。 ４　试剂和材料 ４．１　所用试剂除特别注明外均为分析纯试剂 ，水为符合 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２规定的一级水 。 ４．２　牛免疫球蛋白 Ｇ酶联免疫吸附检测试剂盒１）：２℃～８℃保存。见附录Ａ。 ４．３　５％氯化钠溶液 。 ５　仪器和设备 ５．１　酶标仪：配备４ ５ ０ｎ ｍ 滤光片。 ５．２　旋涡振荡器 。 ５．３　可调移液器 ：单道２ ０μＬ，５ ０μＬ，１ ０ ０μＬ，１０ ０ ０μＬ；多道２ ５ ０μＬ。 ５．４　天平：感量０． ０ ０ １ｇ。 １）　望尔牛免疫球蛋白 Ｇ酶联免疫吸附试剂盒是适合的市售产品的实例 。给出这一信息是为了方便本标准的使 用者，并不表示对该产品的认可 。如果其他产品具有相同的效果 ，可经实验评估后使用这些等效产品 。６　试样的制备和保存 ６．１　称取待测样品 ０． ０ ２ｇ溶于２ ０ｍＬ５％ 氯化钠溶液中 （终浓度为 １ｍｇ／ｍＬ） ，用旋涡振荡器旋转振 １犛 犖／犜３ １ ３ ２—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.荡２ｍ ｉ ｎ，制备成试样储备液 。 ６．２　配制好的试样储备液 ，按照１∶１ ９（体积比）用稀释液进行稀释 （２ ０μＬ试样溶液 ＋３ ８ ０μＬ稀释 液） ，用旋涡振荡器旋转振荡 ２ｍ ｉ ｎ，得到试样溶液 。试样溶液取 ４ ０μＬ用于测定 。试样溶液稀释倍数 为２ ０倍。 ７　洗涤工作液的配制 用水将２ ０倍的浓缩洗涤液按 １∶１ ９（体积比）进行稀释 ，用于酶标板的洗涤 。２℃～８℃保存。 ８　测定 ８．１　使用前将全部试剂在室温下放置 １ｈ～２ｈ。 ８．２　按每个标准溶液和试样溶液至少两个平行计算 ，将所需数目的酶标板条插入板架中 。 ８．３　测定前用洗涤工作液洗涤一次酶标板条 ，每孔２ ５ ０μＬ，洗涤时应用洗涤工作液浸泡酶标板孔 ２ｍ ｉ ｎ，将孔内液体甩干 ，再用吸水纸拍干 。 ８．４　每孔加标准溶液或试样溶液 ４ ０μＬ后，再加抗牛免疫球蛋白 Ｇ抗体工作液 ６ ０μＬ，轻轻振荡混匀 。 用盖板膜盖板 ，置３ ７℃下反应１ ０ｍ ｉ ｎ。 ８．５　每孔加酶标记抗抗体 ５ ０μＬ，轻轻振荡后 ，用盖板膜盖板后置 ３ ７℃下反应３ ０ｍ ｉ ｎ。 ８．６　小心揭开盖板膜 ，将孔内液体甩干 ，用洗涤工作液 ２ ５ ０μＬ充分洗涤 ４次～５次，每次间隔 １ ０ｓ，用 吸水纸拍干 。 ８．７　每孔加底物液 Ａ液和Ｂ液各５ ０μＬ，轻轻振荡混匀于 ３ ７℃下避光显色 １ ５ｍ ｉ ｎ。 ８．８　每孔加终止液 ５ ０μＬ，轻轻振荡混匀 ，置酶标仪于 ４ ５ ０ｎ ｍ 波长处测量吸光度值 。 ９　结果计算 ９．１　计算相对吸光度值 用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算 。见式（１） ： 相对吸光度值 ＝犅 犅０×１ ０ ０％ …………………………（ １） 　　式中： 犅— — —标准（试样）溶液的吸光度值 ； 犅０— — —空白（浓度为０的标准溶液 ）的吸光度值 。 ９．２　绘制标准曲线 以标准溶液牛免疫球蛋白 Ｇ的浓度（ｍｇ／Ｌ）的对数值 （ｌ ｏｇ）为横坐标 ，以相对吸光度值为纵坐标 ，绘 制标准曲线 ，标准曲线的绘制可使用数据分析软件 ，绘制的标准曲线参见附录 Ｂ。每次测定应重新绘制 标准曲线 。 ９．３　计算样品中牛免疫球蛋白 犌含量 利用标准曲线求得试样溶液相对吸光度值所对应的牛免疫球蛋白 Ｇ的浓度，并计算样品中牛免疫 球蛋白Ｇ的含量，见式（２） ： ２犛 犖／犜３ １ ３ ２—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.犡＝犮ｔ×犖 １０ ０ ０×１ ０ ０％ …………………………（ ２） 　　式中： 犡— — —样品中牛免疫球蛋白 Ｇ的含量，％； 犮ｔ— — —利用标准曲线求得试样溶液相对吸光度值所对应的牛免疫球蛋白 Ｇ浓度，ｍｇ／Ｌ； 犖— — —试样溶液的稀释倍数 ，本方法中试样溶液稀释倍数为 ２ ０。 １ ０　结果表述 样品中牛免疫球蛋白 Ｇ的含量为 ×％。 １ １　质量控制 １ １．１　本方法使用中应当用空白样品添加牛免疫球蛋白 Ｇ标准品进行试验质量控制 。 １ １．２　本方法的变异系数应不大于 ２ ０％。 １ １．３　在空白牛乳粉样品中添加回收率及浓度范围 ： ａ）　添加浓度为 １ ０ｍｇ／ｇ，回收率为 ６ ７． ９％～９ ４． ７％； ｂ）　添加浓度为 ２ ０ｍｇ／ｇ，回收率为 ７ ７． １％～９ ２． ４％； ｃ）　添加浓度为 ５ ０ｍｇ／ｇ，回收率为 ８ ０． ９％～９ ９． ３％； ｄ）　添加浓度为 ２ ０ ０ｍｇ／ｇ，回收率为 ７ ６． ４％～９ ４． ８％。 ３犛 犖／犜３ １ ３ ２—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犃 （规范性附录 ） 牛免疫球蛋白 犌酶联免疫吸附检测试剂盒组成 犃．１　牛免疫球蛋白 Ｇ标准溶液 ：０ｍｇ／Ｌ、０． ２ｍｇ／Ｌ、０． ８ｍｇ／Ｌ、３． ２ｍｇ／Ｌ、１ ２． ８ｍｇ／Ｌ、５ １． ２ｍｇ／Ｌ。 犃．２　牛免疫球蛋白 Ｇ抗体工作液 。 犃．３　辣根过氧化物酶标记抗抗体工作液 。 犃．４　２ ０倍浓缩洗涤液 氯化钠　　　　　　　　　　　　　　 １ ６ ０ｇ 磷酸二氢钾 ４ｇ 磷酸氢二钠 ５ ８ｇ 氯化钾 ４ｇ 吐温 ２ ０ １ ０ｍＬ 加去离子水或蒸馏水至 １０ ０ ０ｍＬ １ ２ １℃高压灭菌 ３ ０ｍ ｉ ｎ，２℃～８℃保存备用 。 犃．５　稀释液 氯化钠（Ｎ ａ Ｃ ｌ） ８ｇ 磷酸二氢钾 （ＫＨ２Ｐ Ｏ４） ０． ２ｇ 磷酸氢二钠 （Ｎ ａ２ＨＰ Ｏ ４） ２． ９ｇ 氯化钾（ＫＣ ｌ） ０． ２ｇ 加去离子水或蒸馏水至 １０ ０ ０ｍＬ 犃．６　底物液Ａ液：０． １％过氧化脲 。 犃．７　底物液Ｂ液：０． １％３ ，３ ′，５，５ ′ 四甲基联苯胺 。 犃．８　终止液：２． ０％硫酸。 犃．９　包被有牛免疫球蛋白 Ｇ抗原的可拆分 ９ ６孔板。 ４犛 犖／犜３ １ ３ ２—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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