SN-T 3084.1-2012 进出口化妆品眼刺激性试验体外中性红吸收法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜３０８４．１—２０１２进出口化妆品眼刺激性试验体外中性红吸收法犗犮犮狌犾犪狉犻狉狉犻狋犪狋犻狅狀狋犲狊狋狅犳犮狅狊犿犲狋犻犮狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋— 犖犲狌狋狉犪犾狉犲犱狌狆狋犪犽犲犪狊狊犪狔狊犻狀狏犻狋狉狅２０１２０５０７发布２０１２１１１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：史喜菊、马贵平、曾静、程树军、李冰玲、李炎鑫、刘全国、刘旭辉。 Ⅰ犛犖／犜３０８４．１—２０１２ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.进出口化妆品眼刺激性试验体外中性红吸收法１　范围本部分规定了用体外中性红吸收法检测化妆品眼刺激性潜力的操作方法。本部分适用于可溶性表面活性剂和以表面活性剂为基础的化妆品原料及配方产品。本部分适用于眼刺激性较弱的产品测试，对于难溶、易挥发、有色和对溶酶体有反应的物质不适用。本部分是化妆品眼刺激性潜力的预筛选试验，可作为体外眼刺激试验组合方法或系列方法的一部分，对化妆品的眼刺激性进行最终分类。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ２２８５　化妆品体外替代试验实验３　术语、定义和缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１　细胞成活力细胞群体总活性的度量参数，在此以５４０ｎｍ处的光吸收值（ＯＤ５４０ｎｍ）表示。３．１．２　相对细胞成活力被试物质细胞成活力与阴性对照细胞成活力的比值，在此以５４０ｎｍ处的相对光吸收值（ＯＤ５４０ｎｍ％）表示。３．２　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＭＥＭ：细胞培养液。ＮＲＵ：中性红。ＤＭＳＯ：二甲基亚砜。ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液（细胞洗涤液）。ＳＤＳ：十二烷基磺酸钠。ＩＣ５０：能使ＢＡＬＢ／ｃ细胞对中性红的吸附能力减少５０％的被试物质的浓度。１犛犖／犜３０８４．１—２０１２ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.４　方法原理化妆品的眼刺激性是评价化妆品卫生质量的一项重要毒理学指标，通常情况下，对眼睛有损害的物质也可以产生细胞毒性效果，因此可通过测试细胞毒性大小反映受试物的眼刺激性。中性红是细胞活力标记物，可以被活细胞吸附并在细胞溶酶体中积蓄，当细胞表面或溶酶体膜改变时，导致中性红吸附减少。死细胞不能积蓄中性红，故不被染色。因此，化妆品体外眼刺激性试验中性红吸收法（ＮｅｕｔｒａｌＲｅｄＵｐｔａｋｅＡｓｓａｙｓ，ＮＲＵ）是通过检测化妆品对小鼠成纤维细胞（ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３）吸附中性红能力的抑制效果，由此反映受试物对细胞膜结构、细胞器功能、物质和能量代谢以及由此导致的细胞增殖和存活力的影响，据此推测其眼刺激性强度。在该试验中，ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３细胞先与受试物孵育，再加入中性红染料继续孵育，加入中性红解除物质溶解细胞中的结晶物终止反应，在波长５４０ｎｍ测定其吸光度值（ＯＤ５４０ｎｍ），由浓度反应曲线测得吸光度降低５０％的受试物浓度，即ＩＣ５０作为毒理学评价指标。５　设备５．１　ＣＯ２培养箱（３７℃±０．５℃ ，５％～７．５％ＣＯ２）。５．２　恒温水浴箱（３７℃±０．５℃ ）。５．３　酶标仪。５．４　振荡器。５．５　超纯水仪。５．６　超净工作台（无菌操作）。５．７　倒置显微镜。５．８　全自动血球计数仪。５．９　微量可调移液器（２μＬ、１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）及相应的吸头。６　试剂和材料６．１　试验用细胞本部分推荐使用小鼠成纤维细胞系  ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３，ＣｌｏｎｅＡ３１［来源于美国培养物保藏中心（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）或欧洲细胞培养物保存中心（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ，ＥＣＡＣＣ）］。应该定期检查细胞是否被支原体污染，尽可能使用传代次数最低的ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３细胞系，通常要小于１００代。培养的适宜条件为３７．５℃ 、７．５％ＣＯ２的湿环境下温育。６．２　细胞洗涤液配制见Ａ．１。６．３　细胞培养液配制见Ａ．２。６．４　处理培养液配制见Ａ．３。２犛犖／犜３０８４．１—２０１２ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.６．５　中性红培养液配制见Ａ．８。６．６　中性红解除物配制见Ａ．９。６．７　阳性对照阳性对照为ＳＤＳ，一般做６个稀释度，分别为１２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ和２０μｇ／ｍＬ，每个稀释度做６个重复（ＳＤＳ浓度曲线图参见附录Ｂ）。６．８　阴性对照阴性对照为不加被试物质对照，其余处理相同，做６个重复。６．９　空白对照细胞培养液对照，在９６孔板的周围孔中只加入细胞培养液。６．１０　被试物质被试物质应在使用前制备，溶解在处理培养液里，也可以用ＤＭＳＯ或乙醇作为溶剂溶解被试物；必要时，可以使用涡旋混合器或超声波处理或３７℃加热等来帮助溶解。被试物以１００倍的最终浓度溶解在适当溶剂里（被试物质的最大浓度不能超过１００μｇ／ｍＬ，最高浓度的ｐＨ范围应该在６．５～７．８），再用处理培养液稀释，培养液中溶剂的终浓度要维持在１％（体积分数）的恒定水平。一般要求做８个浓度稀释，首次测试时浓度范围要广，从０．０１ｍｇ／Ｌ～１０／１００ｍｇ／Ｌ，此后可以缩小范围，从０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ，每个稀释度做６个重复。７　试验步骤７．１　用细胞培养液准备浓度为１×１０５细胞／ｍＬ的细胞悬液，在９６孔板的周边孔中只加培养液（１００μＬ／孔）作为空白对照。其余孔中加入细胞悬液（１００μＬ／孔），使细胞终浓度达到１×１０４细胞／孔。于７．５％ＣＯ２、３７．５℃ 条件下培育２４ｈ，至细胞长成单层。７．２　弃掉培养液，每孔加入ＰＢＳ（１５０μＬ）洗涤２次。再分别于相应孔内加入８个稀释度的被试物质及阳阴性对照（１００μＬ／孔），每个稀释度要做６个重复。于７．５％ＣＯ２、３７．５℃ 条件下继续培养２４ｈ。７．３　在倒置显微镜下观察细胞，记录因被试物的细胞毒效应引起的细胞形态学变化。７．４　每孔加入１５０μＬＰＢＳ洗涤细胞，轻轻移去洗液；再分别于每孔加入１００μＬ含中性红的培养液，于７．５％ＣＯ２、３７．５℃ 条件下继续培育３ｈ。７．５　培育结束后，移去中性红培养液，每孔加入１５０μＬＰＢＳ洗涤细胞。７．６　弃掉洗涤液，每孔加入１５０μＬ中性红解除物（乙醇／乙酸溶液），持续振荡１０ｍｉｎ，直至中性红被吸附形成均匀的溶液。７．７　测量终溶液５４０ｎｍ处光密度值（ＯＤ５４０ｎｍ，以３８０ｎｍ为参照），与没有用被试物质处理的对照样品比较，根据浓度 反应曲线推断，计算能抑制５０％中性红吸附的被试物质的浓度，该ＩＣ５０值就是毒性终点（表示为μｇ／ｍＬ或者ｍｍｏｌ／Ｌ）。３犛犖／犜３０８４．１—２０１２ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.８　结果评价８．１　数据处理每个样品的最终ＯＤ值都要从原始值中减去空白对照孔的ＯＤ值以减小背景误差。采用式（１）计算平均值：ＯＤ５４０ｎｍ＝∑ＯＤ５４０ｎｍ犖…………………………（１）式中：ＯＤ５４０ｎｍ　— — —平均ＯＤ５４０ｎｍ； ＯＤ５４０ｎｍ— — —各个重复ＯＤ５４０ｎｍ之和；犖 — — —重复个数。采用式（２）计算相对

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