书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜０ １ ７ ６—２ ０ １ ３ 代替Ｓ Ｎ０ １ ７ ６ —１ ９ ９ ２ 出口食品中蜡样芽胞杆菌检测方法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犮 犲 狉 犲 狌 狊 犻 狀犳 狅 狅 犱 狊犳 狅 狉犲 狓 狆狅 狉 狋 ２ ０ １ ３０ ３０ １发布 ２ ０ １ ３０ ９１ ６实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。 本标准代替 Ｓ Ｎ０ １ ７ ６ —１ ９ ９ ２《出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法 》 。 本标准与 Ｓ Ｎ０ １ ７ ６ —１ ９ ９ ２相比，主要技术变化如下 ： — — —发布单位改为 “中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 ” ，标准名称改为 “出口食品中蜡样 芽胞杆菌检测方法 ” ； — — —增加前言 ； — — —“主要内容与适用范围 ”改为“范围” ，内容修改为 “本标准规定了出口食品中蜡样芽胞杆菌的检 验方法。本标准适用于食品中蜡样芽胞杆菌的检验 ” ； — — —增加检验流程图 ； — — —结构上变化 ，将Ｓ Ｎ０ １ ７ ６ —１ ９ ９ ２中的两种方法分为 “第一法”和“第二法” ； — — —增加了稀释液 “０． ８ ５％生理盐水 ” ； — — —将取样量 “５ ０ｇ”修改为“２ ５ｇ” ； — — —增加计数公式 犖＝∑珔犪 犞×１．１×犱； — — —将培养温度 ３ ０℃改为３ ０℃±１℃ ； — — —将证实试验的培养温度由 ３ ０℃改为３ ６℃±１℃ ； — — —增加了Ａ Ｐ Ｉ５ ０ＣＨＢ 诊断试剂条和 Ｖ Ｉ Ｔ ＥＫ 全自动微生物鉴定系统 ； — — —“补充件”改为“规范性附录 ” 。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ：张泓、刘新亮、庞均予、李铁柱、高勇。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： — — —Ｓ Ｎ０ １ ７ ６ —１ ９ ９ ２。 Ⅰ犛 犖／犜０ １ ７ ６—２ ０ １ ３ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.出口食品中蜡样芽胞杆菌检测方法 １　范围 本标准规定了出口食品中蜡样芽胞杆菌的检测方法 。 本标准适用于食品中蜡样芽胞杆菌的检测 。 ２　设备和材料 ２．１　烘干箱：１ ８ ０℃。 ２．２　培养箱：３ ０℃±１℃ 和３ ６℃±１℃ 。 ２．３　厌氧培养箱 ：３ ６℃±１℃ 。 ２．４　水浴锅：４ ６℃±１℃ 。 ２．５　ｐＨ计：２ ５℃测量，精度±０． １ｐＨ单位。 ２．６　旋转混合器 。 ２．７　培养皿：直径９ ０ｍｍ 或１ ０ ０ｍｍ 或者是１ ４ ０ｍｍ 。 ２．８　吸量管：容量１ ０． ０ｍＬ 和１． ０ｍＬ ，具０． ５ ｍＬ 和０． １ｍＬ 刻度。 ２．９　显微镜。 ２．１ ０　微量移液器 ：容量１ ０． ０ｍＬ 和１． ０ｍＬ ，具０． １ｍＬ 刻度。 ２．１ １　均质器：拍击式或蠕动式 。 ２．１ ２　高压蒸汽灭菌器 。 ２．１ ３　Ａ Ｐ Ｉ５ ０ＣＨＢ 或Ｖ Ｉ Ｔ ＥＫ 全自动微生物鉴定系统１）。 ３　培养基和试剂 ３．１　甘露醇卵黄多粘菌素琼脂 （ＭＹ Ｐ） ：见附录Ａ中Ａ． １。 ３．２　胰蛋白胨大豆多粘菌素肉汤 （Ｔ Ｓ Ｐ Ｂ） ：见Ａ． ２。 ３．３　胰蛋白胨大豆羊血琼脂平板 （Ｔ Ｓ Ｓ Ｂ） ：见Ａ． ３。 ３．４　酚红葡萄糖肉汤 ：见Ａ． ４。 ３．５　硝酸盐肉汤 ：见Ａ． ５。 ３．６　营养琼脂 ：见Ａ． ６。 ３．７　Ｌ 酪氨酸营养琼脂 ：见Ａ． ７。 ３．８　溶菌酶营养肉汤 ：见Ａ． ８。 ３．９　改良Ｖ  Ｐ培养基：见Ａ． ９。 １）　Ａ Ｐ Ｉ５ ０ＣＨＢ 和Ｖ Ｉ Ｔ ＥＫ 全自动微生物鉴定系统由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名 。给出这一信息 是为了方便本标准的使用者 ，并不表示对该产品的认可 。如果其他等效产品具有相同的效果 ，则可使用这些等 效的产品 。３．１ ０　动力培养基 ：见Ａ． １ ０。 ３．１ １　磷酸盐缓冲液 ：见Ａ． １ １。 １犛 犖／犜０ １ ７ ６—２ ０ １ ３ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.３．１ ２　碱性复红液 ：见Ａ． １ ３。 ３．１ ３　０． ８ ５％生理盐水 ：见Ａ． １ ４。 ３．１ ４　亚硝酸盐试剂 ：见Ａ． １ ５。 ３．１ ５　Ｖ  Ｐ试剂：见Ａ． １ ６。 第一法　蜡样芽胞杆菌平板计数法 ４　检验程序 蜡样芽胞杆菌平板计数法的检测程序见图 １。 图１　蜡样芽胞杆菌平板计数法的检测程序 ２犛 犖／犜０ １ ７ ６—２ ０ １ ３ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.５　操作步骤 ５．１　样品的稀释 ５．１．１　固体和半固体样品 ：称取２ ５ｇ样品置于盛有 ２ ２ ５ｍＬ 磷酸盐缓冲液或 ０． ８ ５％生理盐水的无菌 均质杯中 ，以８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ～１ ００ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ的转速均质 １ｍ ｉ ｎ～２ｍ ｉ ｎ，或放入盛有 ２ ２ ５ｍＬ 稀释液的无菌 均质袋中 ，用拍击式均质器拍打 １ｍ ｉ ｎ～２ｍ ｉ ｎ，制成１∶１ ０样品匀液 。 ５．１．２　液体样品 ：以无菌吸管吸取 ２ ５ｍＬ样品置于盛有 ２ ２ ５ｍＬ 磷酸盐缓冲液或 ０． ８ ５％生理盐水的 无菌稀释瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ）中充分混匀 ，制成１∶１ ０样品匀液 。 ５．１．３　用１ｍＬ的无菌吸管或微量移液器吸取 １∶１ ０样品匀液 １ｍＬ，加到盛有 ９ｍＬ磷酸盐缓冲液或 ０． ８ ５％生理盐水的试管中 ，充分混匀 ，制成１∶１ ０ ０ 的样品匀液 。 ５．１．４　按５． １． ３操作程序 ，制备１ ０倍系列稀释样品匀液 ，直至适宜稀释倍数 。 ５．２　样品的接种 根据对样品污染状况的估计 ，选择２～３个适宜稀释度的样品匀液 （液体样品可包括原液 ） ，在进行 １ ０倍递增稀释时 ，每个稀释度分别吸取 ０． １ｍＬ 样品匀液加入 ＭＹ Ｐ琼脂平板 ，然后用无菌 Ｌ棒均匀涂 布于整个平板 ，注意不要触及平板边缘 ，每个稀释度接种两个 ＭＹ Ｐ琼脂平板 。 ５．３　培养 ５．３．１　在通常情况下 ，涂布之后将平皿静置 １ ０ｍ ｉ ｎ～３ ０ｍ ｉ ｎ，待样品匀液吸收后翻转平板 ，３ ０℃±１℃ 培 养２ ４ｈ。如果培养物的菌落特征不显著 ，则继续培养至 ４ ８ｈ。 ５．３．２　蜡样芽胞杆菌在 ＭＹ Ｐ琼脂平板上生长的典型菌落为直径 ２ｍｍ～５ｍｍ，菌落表面粗糙 ，在深 红色背景下呈现粉红色或微粉红色 ，环绕产生 ５ｍｍ宽的卵磷脂酶沉淀环 。没有根状生长的特性 （蕈状 芽胞杆菌形成根状生长的特征 ） 。 ５．４　菌落计数 选取菌落数在 １ ５Ｃ ＦＵ ～１ ５ ０Ｃ ＦＵ 的典型或可疑蜡样芽胞杆菌菌落的平板 ，进行计数 。 注：如果有很多发酵甘露醇的细菌 ，会影响到典型菌落 ，使之减少或消失 。少量的蜡样芽胞杆菌无卵磷脂酶沉淀 环，这些菌同样需要证实试验 。 ５．５　营养琼脂斜面或平板培养 从每个平板上挑取 ５个典型菌落 ，如无典型菌落则挑取可疑菌落 。用接种针接触菌落中心部位 ，分 别接种于营养琼脂斜面或平板 ，３ ０℃±１℃ 培养２ ４ｈ，取培养物进行革兰氏染色和证实试验 。 ５．６　证实试验 ５．６．１　葡萄糖发酵试验 ：将培养物接种到酚红葡萄糖肉汤中 ，置于厌氧培养箱中 ３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ， 振摇后肉汤由红变黄 ，表明在厌氧条件下蜡样芽胞杆菌分解葡萄糖产酸 。 ５．６．２　硝酸盐还原试验 ：将培养物接种到硝酸盐肉汤中 ，３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ，加０． ２ ５ｍＬ 亚硝酸盐 试剂Ａ和０． ２ ５ｍＬ 亚硝酸盐试剂 Ｂ，在１ ０ｍ ｉ ｎ内变为红色为阳性反应 。 ５．６．３　改良Ｖ  Ｐ试验：将培养物接种到改良 Ｖ  Ｐ培养基中 ，３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ，取１ｍ Ｌ培养物置于灭 菌空试管中加入 ０． ２ｍ Ｌ４ ０％ＫＯＨ 溶液和０． ６ｍ Ｌ５％ α萘酚乙醇溶液和少量结晶肌酸 。静置１ｈ出现伊 红粉红色为阳性 。 ５．６．４　Ｌ 酪氨酸分解试验 ：将培养物接种到 Ｌ 酪氨酸琼脂培养基上 ，３ ６℃±１℃ 培养４ ８ｈ，在靠近菌 ３犛 犖／犜０ １ ７ ６—２ ０ １ ３ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.落生长的地方培养基为透明的 ，则表明酪氨酸被分解 ，阴性则继续培养至 ７ ２ｈ，结果仍为阴性的弃去 。 ５．６．５　溶菌酶试验 ：将培养物接种到 ０． ０ ０ １％ 溶菌酶营养肉汤中 ，另取培养物接种到普通营养肉汤中 作对照，３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ，蜡样芽胞杆菌在本培养基中能生长 ，为阳性反应 。如出现阴性反应继续 培养２ ４ｈ，结果仍为阴性弃去 。 ５．６．６　符合ＭＹ Ｐ琼脂上的典型菌落形态 ，镜检为革兰氏染色阳性大杆菌 ，呈链状，芽胞呈椭圆形位于 菌体中央或偏端 ，并且在厌氧条件下发酵葡萄糖产酸 ，还原硝酸盐为亚硝酸盐 ，改良Ｖ  Ｐ试验阳性 ，分 解Ｌ 酪氨酸，能在０． ０ ０ １％ 溶菌酶中生长的进行如下试验 。 ５．６．７　蜡样芽胞杆菌与类似菌的