ICS65.020. 20 B 05 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB 64/T 995---2014 香石竹组织培养技术规程 2014-09-25发布 2014-09-25实施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 DB64/ T 995—-2014 前言 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏回族自治区林业厅提出并归口。 本标准主要起草单位：宁夏大学、中国农科院蔬菜花卉研究所、宁夏周景世荣进出口公司。 本标准主要起草人：张黎、刘春、刘静、钱丽娟、唐渊、彭佳佳、王小军、刘佳琦、李娜、党春娇。 DB64/T995--2014 香石竹组织培养技术规程 1范围 本标准规定了香石竹组织培养的术语和定义、生产及技术流程、炼苗、移栽。 本标准适用于香石竹试管苗工厂化生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T628-2011化学试剂硼酸 GB/T 647-2011 化学试剂硝酸钾 GB/T 659-2011 化学试剂硝酸铵 GB/T 664-2011 化学试剂七水合硫酸亚铁（硫酸亚铁） GB/T 665-2007 化学试剂五水合硫酸铜（I）（硫酸铜) GB/T 666-2011 化学试剂七水合硫酸锌（硫酸锌） GB/T 671-1998 化学试剂硫酸镁 GB/T 1274-2011 化学试剂磷酸二氢钾 GB/T 1270-1996 化学试剂六水合氯化钻(氯化钴) GB/T 1272--2007 化学试剂碘化钾 GB/T 1401--1998 化学试剂乙二胺四乙酸二钠 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T15899-1995 化学试剂一水合硫酸锰(硫酸锰) GB19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 22278-2008 良好实验室规范原则 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 植物组织培养 在无菌条件下，创造植物生长最适宜环境条件，采用人工配制的营养基对离体器官、组织、细胞、 原生质体等进行培养，最后形成完整植株的过程。 3.2 外植体 DB64/ T 995--2014 用于离体培养的初始材料。 3.3 初代培养 又称诱导培养，指最初的外植体在无菌的条件下进行培养产生愈伤组织、不定芽的过程。 3.4 继代培养 将初代培养获得的培养物转移到新的培养基上继续培养的过程。 3.5 玻璃化 试管苗不断进行扩繁时，培养物的嫩茎、叶片呈半透明、水溃状的现象。 4香石竹组织培养技术 4.1实验室要求 香石竹组织培养实验室包括：洗涤室、准备室、接种室、培养室，同时配备完善的水、电、暖供 应系统。根据实验操作程序排列实验室，接种室和培养室设在与外界环境隔离性好的区域，准备室与接 种室相邻，洗涤室远离接种室、培养室、准备室。实验室应符合GB/T22278-2008和GB19489的要求。 4.2主要仪器及设备 4.2.1洗涤室：水槽、药品柜、冰箱等。 4.2.2准备室：高压蒸汽灭菌锅、烘干箱、超净水仪、实验台等。 4.2.3无菌接种室：超净工作台、紫外灯等。 4.2.4培养室：培养架、紫外灯及控温、控湿、控时设备等。 4.3培养基及其配制 4.3.1 母液的配制 香石竹组织培养以MS培养基为基本培养基，所用药品均符合GB/T659-2011、GB/T647-2011、 GB/T671-1998、GB/T1274-1993、GB/T666-1993、GB/T15899-1995、GB/T628-1993、GB/T1272-2007、 GB/T665-2007、GB/T1270-1996、GB/T664-2011、GB/T1401-1998的规定。配制好的母液分别贴上标签， 注明日期、配制倍数。母液贮存在2℃～4℃的冰箱中。 4.3.2植物生长调节剂配制 萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）先用少量95%乙醇溶解，然后加水定容。6-苯氨基嘌呤（6-BA） 6-糠基氨基嘌呤（KT）先溶于少量1mo1/L的盐酸中，再加水定容。所用水应符合GB/T6682-2008的要求。 4.3.3培养基配制 DB64/T995---2014 香石竹MS培养基所需蔗糖的浓度35g/L，琼脂浓度5.5g～6.5g/L。初代培养基中加入4g/L聚丙烯酰 胺，减少香石竹组织培养玻璃化。 4.3.3.1MS培养基配制 根据配方要求，分别取出母液中所需的用量，放入同一烧杯中，并用天平称取蔗糖、琼脂放在一边 备用。将蒸馏水煮沸。将称好的琼脂加蒸馏水，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。 将所取的各种物质，加入煮好的琼脂中。，再加水定容，搅拌均匀。用1mo1/L的氢氧化钠或盐酸，香石 竹培养基最佳pH值为5.86.0，使用精密pH试纸测定调整，配成基本培养基。 4.3.3.2初代培养基配制配方 MS（Mg、Fe加倍）+KT0.3mg/L+6-BA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+4g/L聚丙烯酰胺。 4.3.3.3继代培养基配制配方 MS（Mg、Fe加倍）+KTO.5mg/L+IBA0.1mg/L。 4.3.3.4生根培养基配制配方 1/2MS（大量元素减半）+IBA0.1mg/L。 4.3.4培养基的分装和灭菌 配制好的培养基趁热分装。分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。分装后进行灭菌，121℃、103kPa 状态下保持20min～25min。 4.4消毒与灭菌 4.4.13 无菌工作条件 保持培养室、接种室清洁卫生，用75%乙醇喷雾使空气降尘。培养室与接种室用紫外线灯灭菌。 4.4.2无菌操作要求 工作台面先用75%乙醇擦拭，再用紫外线灯照射20min。操作前将手洗净，用75%乙醇擦拭双手和培 养容器外表面。 4.5香石竹初代培养 4.5.1外植体的消毒 取生长健壮的侧芽，去除叶片，用蒸馏水冲洗，在超净工作台上用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞 溶液消毒8min，最后用无菌水漂洗3次。 4.5.2培养条件 培养室温度22℃～26℃，：16h光照，25001x～30001x光强。 4.5.3香石竹外植体获得 在双目解剖镜下，用解剖刀将侧芽外部嫩叶连基部完全剥去，让茎尖充分暴露，将茎尖切下，长度为 0.3mm～0.5mm，带有2个～4个叶原基，切后迅速接种于初代培养基表面。 3 DB64/ T 995--2014 4.6香石竹试管苗继代培养 当大量丛生芽形成后，将丛生芽转接到继代培养基上培养，形成完整的试管苗。增值继代培养周期 为20d～25d，增殖培养代数控制在15代～20代。 4.7香石竹试管苗生根培养 选取株高3cm～4cm，生长健壮的香石竹试管苗，接种在生根培养基中培养。 5 炼苗移栽 5.1炼苗 待香石竹试管苗平均长出3条～5条，1cm～1.5cm长的健壮根后，移入温室中，将组培苗瓶盖打开， 环境湿度保持75%以上，温度23℃～27℃，进行炼苗，3d～4d后移栽。 5.2移裁 将炼苗后的香石竹试管苗用镊子轻轻取出，洗净粘附在根上的琼脂，移栽到蛭石中或进口草炭：蛭 石=2：1基质的穴盘中，遮阳75%以上，每天喷雾3次～5次，保持叶面湿度80%～90%。 5.3出苗 穴盘苗培育40d～60d，苗高6cm～8cm，根系长满穴盘，可出苗。 . DB64/ T 995--2014 4.6香石竹试管苗继代培养 当大量丛生芽形成后，将丛生芽转接到继代培养基上培养，形成完整的试管苗。增值继代培养周期 为20d～25d，增殖培养代数控制在15代～20代。 4.7香石竹试管苗生根培养 选取株高3cm～4cm，生长健壮的香石竹试管苗，接种在生根培养基中培养。 5 炼苗移栽 5.1炼苗 待香石竹试管苗平均长出3条～5条，1cm～1.5cm长的健壮根后，移入温室中，将组培苗瓶盖打开， 环境湿度保持75%以上，温度23℃～27℃，进行炼苗，3d～4d后移栽。 5.2移裁 将炼苗后的香石竹试管苗用镊子轻轻取出，洗净粘附在根上的琼脂，移栽到蛭石中或进口草炭：蛭 石=2：1基质的穴盘中，遮阳75%以上，每天喷雾3次～5次，保持叶面湿度80%～90%。 5.3出苗 穴盘苗培育40d～60d，苗高6cm～8cm，根系长满穴盘，可出苗。 .