ICS 65.020 B 16 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB 64/T 9562014 葡萄种条病毒检测方法 2014-03-24发布 2014-03-24实施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 DB64/ T 9562014 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏农林科学院、国家葡萄产业技术体系贺兰山东麓综合试验站提出。 本标准由宁夏回族自治区林业局归口。 本标准由宁夏农林科学院植物保护研究所起草。 本标准主要起草人：王国珍、沙月霞、姜彩鸽、张怡、陈卫平、樊仲庆、牛锐敏。 DB64/ T 9562014 葡萄种条病毒检测方法 范围 本标准规定了葡萄种条病毒检测方法的术语和定义、检测对象、检测样本的采集方法和检测方法。 本标准适用于葡萄种条病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY469葡萄苗木 NY/T1843-2010葡葡无病毒母本树和苗木 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 .3. 1 葡萄种条 用于生产嫁接苗、扦插苗的砧木及接穗品种的一年生枝条。 3.2 检测方法 指示植物、酶联免疫（ELISA)和反转录聚合酶链反应（RT-PCR） 检测对象 葡萄扇叶病毒（Grapevinefanleafvirus，GFLV）、葡萄卷叶病毒I（Grapevineleafrollassociatedvirus 1，GLRaV-1）、葡萄卷叶病毒3（Grapevineleafrollassociatedvirus3，GLRaV-3）、葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus，GFkV). 5检测样本采集方法 5.1 采穗圃内检测样本的采集 DB64/T956—2014 在葡萄新梢生长期至葡萄成熟期，对采穗圃内品种进行鉴定的同时，定期调查病毒病的发生情况。 选择品种纯正，无病毒发生的植株用红色油漆标记，作为葡萄病毒检测样品。检测样本采集时间和采集 部位见表1。 表1ELISA和RT-PCR检测适宜时期和取样部位 ELISA 检测 RT-PCR检测 病毒种类 适宜时期 取样部位 适宜时期 取样部位 树体上部的嫩叶及种条 树体上部嫩叶及种条 葡萄扇叶病毒（GFLV） 开花期前后 开花期前后 韧皮部 韧皮部 葡萄卷叶病毒1（GLRaV-1) 树体下部叶片或成熟 树体下部叶片或成熟 果实转色期以后 果实转色期以后 葡葡卷叶病毒3（GLRaV-3） 枝条韧皮部 枝条韧皮部 葡萄斑点病毒（GFkV） 开花期前后 嫩叶 休眠期 休眠枝条韧皮部 5.2外调种条的检测 取种条韧皮部进行病毒检测。 6检测方法 病毒检测采用指示植物、ELISA和RT-PCR方法。 6.1指示植物检测方法 6.1.1GFLV、GLRaV-1、GLRaV-3和GFkV均可采用指示植物进行检测，指示植物有：草本指示植物和 本本指示植物，检测用指示植物和症状表现见表2。 表2葡萄病毒在指示植物上的症状表现 木本指示植物 草本指示植物 沙地葡萄圣乔治 昆诺阿藜 千日红 病毒种类 欧洲葡菊 普通烟 (Vitis rupestris (Chenopodium (Gomphrena (Vitis vinifera) ") (LN33) St.George) quinoa Willd) globosa) 局部红色坏死 葡萄扇叶病毒 叶片出现褪绿斑 局部褪绿斑，系 斑，系统褪绿， (GFLV) 点、呈扇形 统斑驳，扭曲 扭曲。 葡萄卷叶病毒 叶向背卷，脉间 产生红色斑块。 (GLRaV-1) 葡萄卷叶病毒3 叶向背卷，叶色紫 叶向背卷，脉间 红，叶脉仍绿。 产生红色斑块。 (GLRaV-3) DB64/ T 9562014 表2(续) 木本指示植物 草本指示植物 沙地葡葡圣乔治 昆诺阿藜 千日红 病毒种类 欧洲葡萄 普通烟 (Vitis rupestris (Chenopodium (Gomphrena (Vitis vinifera)" (LN33) St.George) quinoa Willd) globosa) 早春、初夏叶片有 葡萄斑点病毒 透明黄斑，夏季症 (GFkV) 状不明显。 注：i）指红色品种，常用的有品丽珠（Cabernetfranc）、赤霞珠（Cabernetsauvingnon）、黑比诺（Pinotnoir Mission）、密笋(Mission）、巴贝拉(Barbera）等。 6.1.2草本指示植物检测，在新梢生长期或秋季，取检测样本，采用常规汁液摩擦接种法。具体方法 为：取待检叶片10g放到钵体中，用剪刀剪碎，加相当于待检样品1~2倍量（w/v）的0.01M磷酸缓冲溶 液，pH7.0~~7.5（含2%烟碱、2%PVP）。在冰浴上研磨，用纱布滤出汁液，然后用脱脂棉球沾汁液，轻轻 涂抹在撒有一层金刚砂的草本指示植物接种叶片上，接种30min左右，用清水冲洗掉接种汁液，培养在 18℃～25℃隔离温室中。接种后每天观察接种叶片症状表现并记录与分析，特别是接种3d～5d后，注 意观察症状的发展。 6.1.3木本指示植物检测，用绿枝嫁接或硬枝嫁接方法，将待检样品嫁接到指示植物上，每个样品重 复3株。嫁接后定期观察指示植物的症状表现。 6.1.4绿枝嫁接具体操作方法如下：指示植物选用2年或1年生根系发达、生长健壮的葡萄苗作为砧 本，待检样品选择无病、粗细适中的健壮枝条作为接穗，用做接穗枝条上的果序和副梢在接前20d～30d 摘除。砧木苗的粗细与接穗枝的粗细要大致相同，均要半木质化，即茎的髓心发白。接穗要随采随用， 嫁接时间一般5月底～6月，宁早勿晚。嫁接时在砧木苗距地面10cm～12cm处剪成平茬，平茬口中间 用刀向下切3cm的切口，切口要南北方向，插入接穗的芽朝南有利于生长。接穗冬芽要饱满圆实，去掉 冬芽旁的副梢芽，再去掉冬芽下的全部叶柄。每个接穗长5cm，在接穗芽上端留1cm，下端留4cm，接 穗芽下两侧1cm处各向下削2.5cm3cm长的楔形斜面，削口要平整光滑。将削好的接穗插入砧木的切 口里，对齐一侧的形成层，即对齐皮层，用宽1cm～1.2cm、长20cm～25cm厚的塑料条包扎砧木，自下 向上绑扎好，再用薄的塑料条把接穗全部缠裹绑紧，只露出芽。接后浇1次透水，以后见干及时浇水， 接后7d～10d萌生新梢。 6.1.5硬枝嫁接具体操作方法如下：指示植物选用生长旺盛、健壮、枝条粗度0.5cm1.0cm的葡萄苗 作为砧木。待检样品选择植株健壮的结果株上的营养枝作为接穗。接穗应为充分成熟、节部膨大、芽眼 饱满、髓部小于枝条直径的1/3、无病虫的1年生枝，接前用清水发泡12h～24h使接穗吸足水分。田 间嫁接一般选择在伤流之前进行。田间供劈接的砧木在离地表10cm～15cm处剪截，在横切面中心线垂 直劈下，深2cm～3cm。接穗选择1个～2个饱满芽，在顶部芽以上2cm和下部芽以下3cm4cm处截取。 在芽下两侧分别向中心切削成2cm～3cm的长削面，削面务必平滑，呈楔形。随即插入砧木劈口，对准 -侧的形成层，然后用宽3cm、长20cm的塑料薄膜，由砧木切口最下端向上缠绕至接芽处，包严接穗 削面后向下反转，在砧木切口下端打结。接芽萌发前，在芽上方，用刀片将包扎带划破1小口，以便新 梢伸出。嫁接后要及时抹除砧木萌藤、及时摘除所有生长点。 6.2ELISA检测方法 6.2.1．GFLV、GLRaV-1、GLRaV-3和GFkV均可采用ELISA方法进行检测。 6.2.2ELISA检测具体操作方法见附录A。 DB64/ T 9562014 6.3RT-PCR检测方法 6.3.1GFLV、GLRaV-1、GLRaV-3和GFkV均可采用RT-PCR方法进行检测。 6.3.2检测程序见附录B。 DB64/T 956--2014 附录.A （规范性附录） ELISA检测 A.1溶液配置 所用化学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。 A.1.1包被缓冲液（碳酸缓冲液） 碳酸钠（NaaCO）1.59g，碳酸氢钠（NaHCOs）2.93g，叠氮化钠（NaNs）0.2g，加入蒸馏水或去离 子水定容至1L，缓冲液pH值为9.6，pH值不需要调整。 A.1.2磷酸盐缓冲液（PBS）×10 氯化钠（NaC1）80g，磷酸二氢钾（KHPOs）2g，磷酸氢二钠（NazHPOs）11.5g，氯化钾（KC1）2g； 叠氮化钠（NaN:）2g，加入蒸馏水或去离子水定容至1L。当稀释到1xs时，溶液的pH值为7.2。 A.1.3冲洗缓冲液（PBST） PBS1L，吐温-200.5ml，调pH值至7.4。 A.1.4样本提取缓冲液 用蒸馏水定容至1000mI，磷酸酯（TRIS）24.2g，聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Mw10,000-40,000）20g， 氯化钠（NaC1）8g，叠氮化钠（NaNs）0.2g，吐温-200.5ml，加蒸馏水或去离子水定容至1L；该缓冲 液比较难溶，如果在加入其它成分之前先用少量的水将PVP弄成“糊”状，将会比较容易溶解。 A.1.5酶标抗体缓冲液 牛血清白蛋白（BSA）0.2g，PBST100ml。调pH值至7.4，4℃储存。 A.1.6底物缓冲液(二乙醇胺缓冲液1M) 二乙醇胺（HN（CHzCH-OH)）90.39g，二乙醇胺-盐酸19.82g，氯化镁（MgC12）0.1g，加入蒸馏水或 去离子水定容至1L；缓冲液的p值为9:8，不需要调整；（二乙醇胺和二