ICS 65.020.30 B 41 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB64/T764——2012 猪流感防制技术规范 2012-03-20发布 2012-03-20实施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 DB64/ T 7642012 前言 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏回族自治区农牧厅提出并归口。 本标准由宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心起草。 本标准主要起草人：李知新、王进香、王晓亮、周海宁、杨春生、张玉玲、张成莲、吴亚文。 DB64/T7642012 猪流感防制技术规范 1范围 本标准规定了猪流感防制技术的诊断方法、疫情报告、疫情处理、预防措施， 本标准适用于猪流感的预防与控制。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T682-2003畜禽场场区设计技术规范 NY/T768-2004高致病性禽流感人员防护技术规范 《病原微生物实验室生物安全管理条例》（中华人民共和国国务院令，2004年第424号） DB64/T766-2012动物疫病应急流行病学调查技术规范 3诊断方法 3.1现场诊断 3.1.1流行病学特点 3.1.1.1传染源主要是病猪和带毒猪，主要通过鼻、咽途径进行传播。潜伏期几小时到数天。自然发 病平均为4d。 3.1.1.2猪流感多呈流行性，发病率可达100%，死亡率小于14.0%。无并发症时，大多数猪只可在3d～ 7d内康复。 3.1.1.3感染流感病毒的人与猪接触后，易引发猪流感。 3.1.2临床症状 一般情况下只有25%～30%的感染猪出现典型的流感症状，多数呈亚临床表现。 3.1.2.1突然发病，常见全群猪迅速出现症状。 3.1.2.2典型症状 病猪体温突然升高到40.3℃～41.5℃，有时可高达42℃。厌食，嗜睡，精神极度委顿，常卧地不起。 呼吸急促、腹式呼吸、夹杂阵发性痉挛性咳嗽。粪便干燥。眼和鼻流出粘性分泌物，有时鼻分泌物带有 血色。无并发症，多数病猪可于6d～7d后康复。 3.1.2.3亚临床症状 1 DB64/T764—2012 呼吸症状很轻，表现非典型增生性肺炎。有时继发或并发猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪呼吸道冠状 病毒、猪胸膜肺炎放射杆菌、支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌等，症状和病变加重。 3.1.3病理变化 3.1.3.1肺脏的病变发生于尖叶、心叶、叶间叶、隔叶的背部与基底部，与周围组织有明显的界限， 颜色由红至紫，塌陷、坚实，韧度似皮革。 3.1.3.2严重病变时，可发生纤维素性肺炎病变。鼻、喉、气管和支气管粘膜充满带血的纤维素性渗 出物，部分出血。支气管淋巴结和纵膈淋巴结肿大、充血、水肿，脾常呈轻度肿大，胃肠有卡他性炎症。 3.2实验室检测 3.2.1病原性检测 要求在生物安全二级以上实验室进行。检测方法按GB19489的规定执行。 3.2.1.1病料采集 病死猪，取肺脏或气管分泌物；待检活猪，用棉拭子采集鼻腔深部分泌物。出现临床症状后24h～ 48h采样最佳。 3.2.1.2病毒分离 按附录A执行。 3.2.1.3分子生物学检测 按附录B执行。 3.2.2血清学检测 见附录C执行。 3.3结果判定 3.3.1疑似猪流感 符合现场诊断，可判为临床疑似病例。 3.3.2确诊猪流感 疑似病例经实验室检测为阳性的可确诊为猪流感。 4头 疫情报告 4.1任何单位和个人发现猪流感或疑似猪流感时，应立即报告当地动物疾病预防控制机构。 4.2上级动物疾病控制机构接到报告后，及时派人到现场协助诊断和紧急处理，并逐级上报。 4.3疫情报告内容按DB64/T766-2012的规定执行。 5疫情处理 2 DB64/T764—2012 5.1发现疫情，应严格采取隔离封锁，扑杀病猪，对动物圈舍、动物排泄物、垫料、污水和其它可能 受污染的物品及场地实行严格消毒。 5.2对受威胁的猪群进行监控，同时根据疫区常见细菌种类使用敏感药物进行预防性投药，防止继发 感染。 5.3密切注意与病猪接触的人员的健康状况，有发热、咳嗽等呼吸道症状，应向动物防疫监督机构和 当地卫生部门报告。 6预防措施 6.1饲养管理 6.1.1猪场的选址和猪舍设计按NY/T682-2003的规定执行。 6.1.2E 由单一饲料改为全日粮饲料，加强营养。 6.1.3加强管理，保持环境清洁。 6.2检疫 6.2.1产地检疫 隔离观察4d，无临床症状的可调出生猪。 6.2.2运输检疫 区内跨省调运活猪或其产品时，应先到当地动物卫生监督机构办理检疫审批手续，经调出地按规定 检疫。排除猪只出现猪流感流行病学特点和临床症状情况，必要时可进行血清学检测，检疫合格方可调 运。调运到达后隔离饲养4d～7d以上，由当地动物卫生监督机构检疫合格后方可投入使用。 6.2.3屠宰检疫 由动物卫生监督机构的检疫人员对猪进行检疫，无临床症状，方可入场屠宰。检疫合格并加盖检疫 标志后方可出厂。不合格猪只按GB16548的规定执行。 6.3国境（口岸）检疫 按《中华人民共和国进出境动植物检疫法》的规定，对出入境动物及其产品的检测。 6.4个人防护 按NY/T768-2004的规定执行。 3 DB64/T7642012 附录A （规范性附录） 鸡胚接种分离猪流感病毒方法 A.1适用范围 此操作规程适用于病猪组织、鼻拭子和分泌物中的猪流感病毒分离。 A.2材料准备 A.2.1 9日龄～11日龄鸡胚及蛋托。 A.2.2碘酊棉球、75%酒精棉及消毒纱布。 A.2.3镊子、打孔器。 A.2.4 一次性1mL注射器。 A.2.5记号笔。 A.2.6医用胶布或石蜡。 A.2.7手套。 A.3试剂 含有抗生素的磷酸盐缓冲液，青霉素、链霉素和制霉菌素等。 A.4操作步骤 A.4.1样品的采集及处理 A.4.1.1样品的采集 病死猪，取肺脏或气管分泌物；待检活猪，用棉拭子采集鼻腔深部分泌物。 A.4.1.2样品的保存 样品应放在含有抗生素（青霉素2000IU/mL、链霉素2mg/mL和制霉菌素1000IU/mL）的磷酸盐缓冲液 （pH7.0～7.4，0.05mo1/L）或25%～50%的甘油生理盐水内，，样品应尽快处理，或置-70℃保存。 A.4.1.3样品处理 取待检病料置研磨器中，按W/V（1:1）加入PBS研磨，将棉拭子置1mL样品采集液管中，充分挤压后 弃去子。4℃8000r/min离心5min。取上清待用。 A.4.2验胚 A.4.2.1将鸡胚气室端朝上放置在蛋盘上，用照蛋器检测鸡胚。 A.4.2.2如果鸡胚没有受精、有裂痕、发育不全、发育终止或表面有许多渗水孔，应弃掉。 4 DB64/ T 7642012 A.4.3鸡胚接种 A.4.3.1通常每个样本接种3个鸡胚。 A.4.3.2用碘棉球和75%酒精棉消毒鸡胚，在气室上方避开鸡胚处钻孔。 A.4.3.3用1m1注射器吸取处理过的试验标本。 A.4.3.4将针头沿小孔刺入尿囊腔，将100uL试验标本注入尿囊腔。 A.4.3.5用医用胶布或熔化的石蜡封口。 A.4.3.6将鸡胚置37℃孵化2d～3d。每天观察鸡胚，将死亡鸡胚置4℃冰箱。 A.4.4鸡胚收获 A.4.4.1用碘棉球和75%酒精棉消毒鸡胚顶部。 A.4.4.2用无菌镊子小心移去气室蛋壳，揭开鸡胚绒毛尿囊膜及羊膜。用无菌注射器吸取鸡胚尿囊液， 置于收集管中。 A.5结果 A.5.1将鸡胚收获液在离心机上3000r/min离心5min，以去除血液和细胞。取上清，进行红细胞凝集试 验。如无红细胞凝集，可将收获的尿囊液用鸡胚盲传两代。红细胞凝集试验操作步骤如下： A.5.1.1微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1成为第1列；平行方向称行，如A1～A12称A行。 A.5.1.2于微量血凝板的A～G排各孔加入50uLPBS，H11与H12孔作为阴性对照，也加入50uLPBS。 A.5.1.3用微量加样器在A～G排第1孔各加入50uL待检病毒样品，每个样品应作两排检验。于H9和H10 孔中加入标准病毒抗原，作为阳性对照。 A.5.1.4加样器从A～G排第1列各孔分别取50μuL病毒液，由第1列至第12列做倍比稀释。最后1列每孔 弃去50μL。 A.5.1.5每孔加入50uL0.5%鸡红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。 A.5.1.6温孵育30min，观察血凝现象并记录结果。 A.5.1.7结果：出现红细胞凝集的最高稀释倍数即为病毒的血凝滴度。 A.5.2如果有血凝现象，按照附录C执行。 5