ICS 点击此处添加中国标准文献分类号 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB 64/ T 1081-2015 葡萄脱毒组培苗繁育技术规程 点击此处添加标准英文译名 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 (送审稿） 2015-09-02发布 2015-09-02实施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 DB64/ T-XXXX 前言 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏回族自治区林业厅提出并归口。 本标准主要起草单位：宁夏林业研究所股份有限公司、宁夏森淼种业生物工程有限公司、种苗生物 工程国家重点实验室、国家经济林木种苗快繁工程技术研究中心、宁夏农垦西夏王实业有限公司葡萄苗 木分公司。 本标准主要起草人：徐美隆、沈效东、李永华、陈春伶、何金柱、谢军、刘玉娟、王巧珍、乔改霞、 郭晓婧。 I DB64/ T-XXXX 葡萄脱毒组培苗繁育技术规程 1范围 本标准规定了葡萄脱毒组培苗的术语与定义、葡萄脱毒技术流程、葡萄脱毒组培苗繁育技术、葡萄 脱毒组培苗商品分级标准、葡萄脱毒组培苗分级检测方法。 本标准适用于葡萄苗脱毒、葡萄脱毒组培试管苗、穴盘苗、营养袋苗的生产管理及葡萄脱毒组培苗 商品质量分级。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）适用于本文件。 DB64/T829-2013葡萄苗木病毒检测技术规程 NY469-2001葡萄苗木 3术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 植物组织培养 指利用植物的器官、组织等作为外植体，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养，以形成再生 植株的技术与方法。 3. 2 葡萄微茎尖培养脱毒技术 根据病毒在植物体内通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统的原理，以不带有病毒 的葡萄顶端分生组织为外植体，通过植物组织培养技术，将其培养成完整植株的技术和方法，该再生植 株通过检测不带有规定病毒。 3.3 葡萄脱毒组培苗 以经过脱毒处理且检测不带有规定病毒的试管苗为母本，通过植物组织培养技术进行快速繁育而成 的葡萄种苗。葡萄脱毒组培苗培育分为四个阶段：葡萄脱毒组培试管苗、葡萄脱毒组培穴盘苗、葡萄脱 毒组培营养袋苗、一年生葡萄脱毒组培自根苗。 1 DB64/T---XXXX 3. 4 葡萄脱毒组培试管苗 是指在试管内培育阶段的葡萄脱毒组培苗。 3.5 葡萄脱毒组培穴盘苗 是指在规定规格穴盘内培育阶段的葡萄脱毒组培苗。 3. 6 葡萄脱毒组培营养袋苗 是指在规定规格营养袋内培育阶段的葡萄脱毒组培苗。 3. 7 一年生葡萄脱毒组培自根苗 是指葡萄脱毒组培营养袋苗在大田培育一年后的自根苗。 4葡萄脱毒技术流程 4.1葡萄组培苗培育 4.1.1培养基配制灭菌 将制备好的各种培养基分装于规格为6cm8cm×12cm的玻璃培养瓶，每瓶30mL～40mL，用封口膜 扎紧，在压力为0.11MPa的高压灭菌锅中灭菌20min，冷却后备用。 4.1.2外植体采集 选择3年～5年树龄、品种纯正的葡萄健壮植株为采样母株，采集带有腋芽的半木质化茎段作为外植 体，采样最佳时期为5月中旬～6月上旬，采集最佳时间为早上10点以前。 4.1.3外植体消毒及启动培养 将采集的外植体在室内用自来水冲洗2h～3h，每个茎段修剪成带有2个3个腋芽，然后置于超净工 作台上，75%乙醇消毒20s～30s，用无菌水清洗3次～5次，0.1%升汞消毒4min～6min，再用无菌水 清洗3次～5次，将茎段两端褐化部分修剪掉后接种于启动培养基（配方见附录A）。暗培养3d后，置 于光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间16h?d的环境下进行培养，整个环节培养温度控制在25℃～28℃ 之间，培养时间30d～40d。 4.1.4增殖生根培养 外植体在启动培养基上培养30d～40d后，将2cm以上带有2个新生芽的茎段剪下接种于增殖生根培 养基（配方见附录A），置于光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间16h·d的环境下进行培养，整个环节 培养温度控制在25℃～28℃之间，每隔28d～30d继代一次。 4.2葡萄组培苗脱毒 4.2.1变温处理 2 DB64/ T—XXXX 将生根后的葡萄组培试管苗置于人工气候培养箱中进行变温处理，处理条件为：在37℃条件下培养 16hd-，在22℃条件下培养8h?d，其中，在37℃条件下培养时为光照培养，光照强度2000Lx～3000Lx 在22℃条件下培养时为暗培养。整个变温处理共计30d。 4.2.2微茎尖培养 将经过变温处理的葡萄试管苗在无菌条件取出，置于解剖镜下进行茎尖剥离，剥离出的茎尖大小为 0.3～0.5mm，快速将剥离出的葡萄茎尖置于经灭菌处理后的茎尖启动培养基（配方见附录A），暗培养 7d～10d，待茎尖开始萌动时进行光照培养，培养条件为：光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间16h·d"， 整个培养过程中，培养温度为25℃～28℃，培养时间为50d～60d。 4.2.3茎尖继代培养 将培养了50d～60d，高度为1cm左右的葡萄新芽置于茎尖继代培养基（配方见附录A），在培养温 度25℃～28℃、光照强度2000Lx3000Lx、光照时间16h?d的条件下培养40d～50d。 4.2.4增殖生根培养 将继代培养后长至2cm以上的再生芽接种于增殖生根培养基（配方见附录A），培养条件与4.1.4相 同，培养时间为28d～30d。 4.3脱毒苗病毒检测 经过脱毒处理后的葡萄再生试管苗长至8cm～10cm时，对其进行病毒检测，检测病毒的种类及检测 方法参照DB64/T829-2013，如果检测的规定病毒均为阴性，确定该植株为葡萄脱毒苗。 51 葡萄脱毒组培苗繁育技术 5.1葡萄脱毒组培试管苗的快繁 将经过病毒检测确认不带有规定病毒的完整植株切成带有2个芽的茎段，接种于增殖生根培养基(配 方见附录A），培养条件与4.1.4相同。 5.2葡萄脱毒组培穴盘苗的培育 5.2.1温室的选择 为满足葡萄脱毒组培穴盘苗培育的要求，应选择未进行过葡萄种植，且严格消毒，具备防虫、遮 阳、微喷等设施的温室，温室周边50m以内没有葡萄种植。 5.2.2葡萄脱毒组培试管苗炼苗 葡萄脱毒试管苗培养18d～20d后，将株高长至5cm～7cm，且有2～3个根，根长为2cm～3cm的葡萄 脱毒试管苗从培养室移至温室进行炼苗，炼苗时间7d～10d，整个炼苗期间光照强度不超过200001x，温 度控制在20℃～30℃，移栽前一天打开瓶盖，用3层湿润的纱布覆盖于瓶口，使得瓶内空气相对湿度控 制在80%以上。 5.2.3葡萄脱毒组培试管苗移栽及管理 将经过炼苗后的葡萄脱毒组培试管苗从培养瓶中取出，剪掉过长的根，保留3cm～4cm长的根，用 清水小心洗净根部的培养基，然后将种苗移栽至规格为50穴的穴盘（穴盘深度为8.5cm），移栽基质配 方为：草炭：蛭石：珍珠岩=1:1:2（V/V/V），同时添加体积比为5～10%的腐熟羊粪，移栽基质在使用前用 50%多菌灵800～1000倍液均匀喷湿消毒。葡萄脱毒试管苗的移栽最佳时间为每年的5月底～8月底。 葡萄脱毒组培试管苗从瓶内移栽至穴盘后12d15d，温室空气相对湿度控制在80%以上，待长出 3