ICS 65.150 CCS B 51 37 山东省 地方标准 DB37/T 4879—2025 大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法 Method for the separation and identification of epiphytic and endophytic bacteria of macroalgae 2025 - 07 - 29发布 2025 - 08 - 29实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4879—2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省海洋局提出并组织实施。 本文件由山东省海洋标准化技术委员会归口。 DB37/T 4879—2025 2 大型海藻附生和内生细菌分离鉴定方法 1 范围 本文件描述了大型海藻附生和内生细菌分离纯化、鉴定和保藏的方法。 本文件适用于大型海藻附生和内生细菌的分离鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 —2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 30744 —2014 深海微生物样品前处理技术规范 DB37/T 4092—2020 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 大型海藻 macroalgae 肉眼可见的、绝大多数是多细胞的丝状体、膜状体、管状体或叶状体植物。 注： 主要包括红藻、绿藻和褐藻。 附生细菌 epiphytic bacteria 定殖于大型海藻藻体表面的细菌。 内生细菌 endophytic bacteria 生长在大型海藻藻体内部的细菌。 4 试剂与耗材 试剂 4.1.1 无菌1×PBS缓冲液： 2 mM KH 2PO4，0.137 M NaCl ，10 mM Na 2HPO4，2.7 mM KCl。 4.1.2 陈海水：天然海水避光保存三周及以上，使用时经孔径 0.45 μm滤膜过滤的滤液。 4.1.3 超纯水：符合 GB/T 6682 —2008中一级水要求。 4.1.4 酒精：75％乙醇。 4.1.5 次氯酸钠溶液：浓度 2.5％。 4.1.6 生理盐水： 0.9％的NaCl溶液。 DB37/T 4879—2025 3 经121 ℃，20 min灭菌处理。 4.1.7 保种液。 向配置好的 0.9％的NaCl 溶液中添加甘油，至终浓度为15％（ V/V），将配置好的保种液置于封闭容 器储存。121 ℃，20 min灭菌处理。 4.1.8 Zobell 2216E 培养基： 5.0 g蛋白胨， 1.0 g酵母膏， 0.01 g FePO 4，20.0 g琼脂（固体培养基 添加），1 000 mL陈海水， pH7.4～7.8 。 121 ℃灭菌20 min 。 4.1.9 无菌液体石蜡。 耗材 4.2.1 细菌基因组 DNA提取试剂盒（市售）。 4.2.2 枪头：材料为聚丙烯的微量加样器套头，规格为 0.2 mL、1.0 mL和5.0 mL。 4.2.3 冻存管：材料为聚丙烯，或其它可耐 121 ℃高温和液氮的塑料管，容积大于或等于 2.5 mL。 4.2.4 其他生物实验常用耗材：纱布、封口膜。 5 仪器与设备 生化培养箱：培养室温度能在 0 ℃～60 ℃范围内调节。 振荡培养箱： 培养室温度能在 0 ℃～60 ℃范围内调节， 转速能在 0 r/min～300 r/min范围内调节。 电子天平：精度为 0.01 g。 玻璃试管：直径×长度为 18 mm×180 mm的平口玻璃试管和直径×长度为 15 mm×150 mm的平口玻 璃试管。 锥形瓶：容量为 250 mL的广口玻璃锥形瓶。 脉冲场电泳仪系统：最高输出电压 350 V，电压连续可调，最大输出电流 0.5 A，转换范围 50 ms到 18 h，转换角度为 0°～360°，包括电泳仪、水浴循环仪和电冰槽。 其他生物实验常规仪器：超净工作台、漩涡振荡器、高压灭菌锅和酒精灯等。 6 藻类样品采集与处理 样品采集 采用随机抽样的方法，选取生长状态良好、长势一致的藻类样本，每株样本的重量约为 30 g；样本 处理前应置于原位海水中或在4 ℃冰箱中保存（不超过24 h），2 h内处理分析。 用121 ℃，20 min灭菌过滤后的海水洗涤清除藻体表面附加的沙粒、沉积物、食草动物和杂藻，备 用。 样品处理 6.2.1 附生细菌样品的处理 称取藻体样品 2.00 g（精确至0. 01 g），置于 250 mL无菌锥形瓶中，加入 18 mL无菌1×PBS缓冲液， 用灭菌封口膜封口，使用振荡培养箱（温度25 ℃，转速 200 r/min）振荡30 min，获取藻体表面分离的附 生细菌悬液。 6.2.2 内生细菌样品的处理 DB37/T 4879—2025 4 6.2.2.1 取洗净的藻体样品 2.00 g放入烧杯中， 先用 75％乙醇浸泡， 后用 2.5％的次氯酸钠溶液浸泡， 浸泡时间根据藻体种类及实际情况确定，浸泡后的藻体使用超纯水清洗 5次以上。为了确定除菌是否彻 底，可将最后一次冲洗液接种在 2216E平板上，若无菌落生长则认为藻体表面除菌彻底。藻体表面除菌 效果记录表，见附录 A。 6.2.2.2 取 6.2.2.1中表面除菌彻底的藻体置于无菌研钵中，加入 18 mL生理盐水研磨，获取内生细 菌悬液，备用。 7 细菌样品的分离与纯化 细菌样品的分离 7.1.1 附生细菌 7.1.1.1 取1 mL附生细菌悬液（ 6.2.1），加入生理盐水进行 10倍系列稀释，获得稀释倍数分别为 10 倍、100倍和1 000倍的样品稀释液，振荡混匀，备用。 7.1.1.2 取6.2.1和7.1.1.1制备的样品各 100 μL，分别涂布于 Zobell 2216E 固体培养基上。 25 ℃ 培养 72 h，每24 h观察记录单菌落形态特征，记录表格见附录 B。 7.1.2 内生细菌 7.1.2.1 取1 mL内生细菌悬液（ 6.2.2.2），加入生理盐水进行 10倍系列稀释，获得稀释倍数 10倍、 100倍和1 000倍的样品稀释液，振荡混匀，备用。 7.1.2.2 取6.2.2.2和7.1.2.1制备的样品各 100 μL， 分别涂布于 Zobell 2216E 固体培养基上。 25 ℃ 培养72 h，每24 h观察记录单菌落形态特征，记录表格见附录 B。 细菌样品的纯化 7.2.1 根据菌落生长状况及菌落形态特征， 选择合适稀释度 （每培养皿 30个～300个菌落） 的培养皿， 进行单菌落挑取，划线纯化。方法如下： a) 菌落数在 30左右的培养皿，每个菌落都挑取，进 行划线纯化； b) 菌落数在 50左右的培养皿，挑取 1/2个培养皿上的单菌落，进行划线纯化； c) 菌落数在 100左右的培养皿，挑取 1/4个培养皿上的单菌落，进行划线纯化； d) 菌落数大于 100的培养皿，挑取特殊的其它培养皿上没有出现过的菌落，进行划线纯化。 7.2.2 观察划线菌落形态特征是否一致，如不一致，再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养菌株， 并填写附录 B菌落形态特征统计表。 8 藻类细菌鉴定与保藏 细菌的鉴定 8.1.1 DNA提取 将获得的纯培养菌株（ 7.2.2）接种于斜面培养试管，培养获得适龄斜面菌苔，加入 4.5 mL灭菌后的 生理盐水通过漩涡振荡器振荡得到菌悬液。按照GB/T 30744相关规定，进行基因组 DNA提取。 8.1.2 细菌基因组 16S rRNA 基因扩增 DB37/T 4879—2025 5 采用细菌通用的正向引物 338F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG -3’)和反向引物 806R(3’- GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’ )对16S rRNA的V3 ＋V4区进行扩增。 8.1.3 PCR产物电泳检测 对扩增所得的PCR 产物进行电泳检测，按照DB37/T 4092—2020相关规定执行。 8.1.4 PCR产物测序及序列比对 对检测合格的 PCR产物进行 Sanger测序，测序结果与模式菌数据库 EzBioCloud 进行序列比对，选取 序列相似度最高的前 10个菌种的序列，与待鉴定菌的序列通过 MEGA中邻接法、最大似然法和最小进化法 三种方法构建系统进化树，将细菌鉴定到种。 细菌的保藏 8.2.1 石蜡油封存 在斜面培养物上，加封一层（ 2 cm～3 cm）无菌液体石蜡，然后置于15 ℃培养箱中保存。 填写《菌 株信息记录表》，见附录 C。 8.2.2 冷冻保存 将获得的纯培养菌株（ 7.2.2）接种于斜面培养试管，获得适龄 斜面菌苔，加入 4.5 mL灭菌后的保种 液，通过漩涡振荡器振荡斜面培养试管，将细菌培养物振荡至保