ICS 65.020.01 CCS B 04 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 4109—2025 番茄病毒RT-PCR检测技术规程 Code of practice for RT -PCR detection of tomato viruses 2025-07-10发布 2025-08-10实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 4109 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（ SAM/TC 25 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古中天现代农牧业开发有限 责任公司、鄂尔多斯市农牧技术推广中心。 本文件主要起草人：张磊、李正男、孙平平、刘燕、王永、杨永青、高婧、廉勇、付崇毅、赵沁、 徐文俊、韩静宇、张静春、徐磊、张佳。 DB15/T 4109 —2025 1 番茄病毒 RT-PCR检测技术 规程 1 范围 本文件规定了番茄病毒检测中的术语和定义、 检测对象、 抽样、 取样、 检测方法和判定规则等内容。 本文件适用于番茄病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 34265 Sanger 法测序技术指南 GB/T 40974 核酸样本质量评价方法 SN/T 2497.21 进出口危险化学品安全试验方法 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 RNA病毒 RNA viruses 核糖核酸病毒，其遗传物质为 RNA。 DNA病毒 DNA viruses 脱氧核糖核酸病毒，其遗传物质为 DNA。 反转录 Reverse reverse transcription （RT） 以RNA为模板，逆转录酶催化合成 DNA的过程。 互补DNA complementary DNA （cDNA） 由逆转录酶催化合成的、与 RNA模板互补的 DNA。 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction （PCR） DB15/T 4109 —2025 2 利用DNA聚合酶， 对 DNA或cDNA模板的特定区域进行体外扩增的技术。 反应混合物通常由 DNA聚合酶、 脱氧核苷三磷酸、引物和缓冲液组成，反应过程主要包括变性、退火和延伸三个步骤。 引物 primers 人工合成的具有一定长度的单链 DNA分子，与 DNA模板链的特定区域互补，其 3’末端在 PCR过程中作 为复制延伸的起始位点。 4 检测对象 主要RNA病毒种类 苜蓿花叶病毒（ Alfalfa mosaic virus ，AMV）。 黄瓜花叶病 毒（Cucumber mosaic virus ，CMV）。 南方番茄病毒（ Southern tomato virus ，STV）。 番茄斑驳花叶病毒（ Tomato mottle mosaic virus ，ToMMV）。 番茄花叶病毒（ Tomato mosaic virus ，ToMV）。 番茄斑萎病毒（ Tomato spotted wilt virus ，TSWV）。 主要DNA病毒种类 番茄黄化曲叶病毒（ Tomato yellow leaf curl virus ，TYLCV）。 5 抽样方法 采用5点法抽样。 种植面积在 2001 m2以内（含 2001 m2） ，抽检100株。种植面积在 2001 m2到20010 m2之间（含 20010 m2） ，前2001 m2抽100株，之后每增 2001 m2增检50株。种植面积超过 20010 m2时，前20010 m2按上述方法抽样，之后每增加 2001 m2增检20株。 6 取样方法 对样方内的番茄进行采样，取靠近顶部的新鲜叶或枝条，掸掉灰尘或其他附着物，除去蚜虫，放置 于自封采样袋内。 采样点距离检测点较远时，用湿纸巾、海绵或布条包裹叶或枝条的切割处，置于采样自封袋内进行 运输。 样品在检测点存储时间较短时（一般不超过 24 h），在4 ℃存放即可。长期存放样品时，需要将样 品用液氮预冷后，保存于 -80 ℃超低温保存箱。 7 检测方法 样品前处理 避开叶片中脉，切取叶片组织用于检测。 DB15/T 4109 —2025 3 样品核酸提取 选择市售的用于提取含有多糖多酚材料的 RNA或DNA的试剂盒，按照试剂盒自带的说明书进行操作。 核酸质量评价按照 GB/T 40974 执行。 反转录 DNA病毒检测不执行该步骤。以提取的质量合格的总 RNA为模板，选择市售的具有基因组 DNA去除功 能的反转录试剂盒进行反转录，合成 cDNA。反应体系和反应程序按照试剂盒自带的说明书进行设置。 PCR扩增 7.4.1 PCR反应体系 市售产品通常为预混液或单品，根据所选产品提供的说明书，进行 PCR反应混合物配制，并按说明 书指示加入 cDNA或DNA模板以及病毒检测引物。各种病毒的 特异性检测引物见表 1。 表1 番茄病毒的特异性检测引物 病毒名称 引物名称 引物序列 /（5’→ 3’方向） 目标DNA片段大小 /（bp） AMV AMV-Fa GTGCGTATAGATGCCGGTTC 900 AMV AMV-Rb GAGCGAATAGGACTTCATACC 900 CMV CMV-F GTTTATTTACAAGAGCGTACGG 632 CMV CMV-R GGTTCGAARRWATAACCGGG 632 STV STV-F TGATGGAGGATATCTACTGTCATT 582 STV STV-R ACAAGATGTTTAAAGCCGTGTCC 582 ToMMV ToMMV-F CTGGAGAAGACTGGGTCTAG 1193 ToMMV ToMMV-R TTCGGTAAGTTCAATGGGACCT 1193 ToMV ToMV-F TCTCAAGAATGTTACACGGGAAG 980 ToMV ToMV-R CGCATTCTCCGTAATTTTGATC 980 TSWV TSWV-F TCACTGTAATGTTCCATAGCAA 861 TSWV TSWV-R AGAGCAATYGTGTCAATTTTATTC 861 TYLCV TYLCV-F TAATCATTTCCACGCCCGTCTCG 648 TYLCV TYLCV-R GGTTCTCATACTTGGCTGCCTCCT 648 TYLCV TYLCV-F CGGGATCCACTTCTAAATG 2800 TYLCV TYLCV-R CGGGATCCCACATATTGCAAG 2800 a F表示上游引物。 b R表示下游引物。 DB15/T 4109 —2025 4 7.4.2 PCR反应程序 95 ℃预变性 2 min。35个反应循环： 95 ℃变性20 s；退火20 s，退火温度按引物合成报告设置， 两个引物退火温度不一致时，取较低温度； 72 ℃延伸，延伸时间根据所选产品说明书提供的参数进行 计算。最后， 72 ℃终延伸 5 min。 琼脂糖凝胶电泳检测 7.5.1 琼脂糖凝胶制备 用Tris-乙酸缓冲液溶解琼脂糖，制备质量体积比为 1%的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的制备按照 SN/T 2497.21执行。 7.5.2 电泳检测 用Tris-乙酸缓冲液，在水平板电泳槽中进行电泳。上样、电泳按照 SN/T 2497.21 执行。电泳结束 时，凝胶置于紫外灯或凝胶成像系统进行观测和拍照，获取的图片用于结果判定。 8 结果判定 异常结果 根据琼脂糖凝胶电泳图，与图中 DNA相对分子质量标准品相比，从阴性对照样品扩增到了预期大小 的DNA片段，或从阴性对照和阳性对照样品均未扩增到预期大小的 DNA片段。此时，判定为检测错误，应 重新进行检测。 阳性结果 从阴性对照样品未扩增到预期大小的 DNA片段，从被检测样品扩增到了预期大小的 DNA片段。有阳性 对照时，从阳性对照扩增的 DNA片段大小，与判定为阳性的样品中扩增的 DNA片段大小一致。此时，判定 被检测样品为阳性，即番茄样品携带了特定的病毒。 阴性结果 从阴性对照和被检测样品中未扩增到预期 大小的DNA片段，从阳性对照中扩增到预期大小的 DNA片 段。此时，判定被检测样品为阴性，即番茄样品未携带被检测病毒。 9 结果验证 当不具备阳性对照，只有阴性对照时，应当随机选取 3～5个被判定为阳性的样品，对其扩增的 DNA 片段进行序列测定，序列测定按照 GB/T 34265 执行，根据序列信息确证是否携带病毒。 10 病毒检出率 按照公式（ 1）。