ICS 65.020.01 CCS B 34 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 4083—2025 甜菜子叶节 遗传转化技术规程 Technical code of practice for genetic transformation of sugar beet cotyledon nodes 2025-06-26发布 2025-07-26实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 4083 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（ SAM/TC 20 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学。 本文件主要起草人：李宁宁、李国龙、孙亚卿、张少英、郭晓彤、李悦、张子健、王帅、徐燕妮。 DB15/T 4083 —2025 II 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本文件 9条遗传转化 与一种甜菜遗传 转化方法内容农杆菌转化、抑菌、筛选、生根等相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构承诺 ,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得： 专利持有人姓名：郭晓彤、张少英、李悦、孙亚卿、李国龙、李宁宁。 地址：内蒙古自治区 呼和浩特市赛罕区学苑东街 275号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责 任。 DB15/T 4083 —2025 1 甜菜子叶节遗传转化技术 规程 1 范围 本文件规定了培养基配方、培养基配置、灭菌、无菌苗培养、诱导分化培养、炼苗移栽及转基因植 物检测等技术要求。 本文件适用于甜菜子叶节遗传转化技术操作。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19176 糖用甜菜种子 DB15/T 2044 农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 甜菜遗传转化 sugar beet genetic transformation 将外源基因转移到甜菜基因组内并稳定整合、表达和遗传，从而使受体甜菜植株表现出目标基因特 征的过程。 农杆菌浸染 Agrobacterium infection 农杆菌浸入并感染甜菜外植体的过程。 子叶节 cotyledon -node 子叶着生的部位。组织培养时，将有子叶着生的外植体节段也叫做子叶节。 4 培养基配方 萌发培养基 用于萌发甜菜种子的营养物制品，萌发培养基成分包括： 1.0 L蒸馏水+1.0 mg/L 6 -BA+8.0 g/L琼 脂，pH为5.8。 DB15/T 4083 —2025 2 悬浮培养基 用于农杆菌浸染液的制备， 悬浮液培养基成分包括： 1/2 MS+50 g/L 蔗糖+5.0 g MES +0.02% silwet - 77，pH为5.8。 预培养基 用于甜菜子叶节的预培养，预培养基成分包括： MS+30 g/L 蔗糖+1.0 mg/L 6 -BA+0.2 g/L酪蛋白 +7.0 g/L琼脂，pH为 5.8。 共培养基 用于甜菜子叶节农杆菌浸染后的共培养，共培养基成分包括： MS+30 g/L 蔗糖+1.0 mg/L 6 -BA+0.2 g/L 酪蛋白+100 μM AS+7.0 g/L 琼脂，pH为5.8。 抑菌培养基 抑菌培养基成分包 括：MS+30 g/L 蔗糖+1.0 mg/L 6 -BA+0.25 mg/L NAA +0.5 mL/L PPM +8.0 g/L 琼 脂+400 mg/mL 特美汀， pH为5.8。 筛选培养基 筛选培养基成分包括： MS+30 g/L 蔗糖+1.0 mg/L 6 -BA+0.25 mg/L NAA +0.5 mL/L PPM +8.0 g/L 琼 脂+6.0 mg/mL 潮霉素， pH为5.8。 分化培养基 分化培养基成分包括： MS+30 g/L 蔗糖+1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA +0.5 mL/L PPM +8.0 g/L 琼 脂，pH为5.8。 生根培养基 生根培养基成分包括： MS+30 g/L 蔗糖+2.0 mg/L NAA +0.5 mL/L PPM +8.0 g/L 琼脂，pH为5.8。 5 培养基制备 根据不同培养基成分进行培养基的配置， 随后放入高压灭菌锅中， 121 ℃、0.11 MPa 下灭菌15 min～ 20 min。待灭菌结束后，在超净工作台中进行培养基的分装。 6 灭菌 器皿灭菌 所用器皿如尖头镊子、解剖刀、手术剪、培养皿、滤纸等放入高压灭菌锅中， 121 ℃、0.11 MPa 下 灭菌 15 min～20 min。待灭菌结束后放入烘箱 80 ℃烘干备用。 种子消毒 将甜菜种子的外壳用砂纸人工打磨光滑，自来水冲洗 30 min，0.1%的HgCl 2溶液处理 10 min，无菌 水清洗3次，放置于灭菌的滤纸上晾 5 min～10 min。 DB15/T 4083 —2025 3 7 无菌苗的培养 选用背景纯合的二倍体糖用甜菜种子，种子质量应符合 GB 19176 的规定。将消毒后的种子接种于萌 发培养基后，置于组培室，于 23 ℃条件下培养 7 d～10 d。 8 诱导分化培养 待芽长2.0 cm～2.5 cm时，带子叶一起切下，接种到新的继代培养基中。于温度 23 ℃、光照强度 3000 Lux 、光照周期 16 h/8 h 条件下培养 3 d～5 d。 9 遗传转化 农杆菌的浸染 将无菌苗子叶节切开形成伤口，在预培养基上进行预培养 1 d～2 d；将含有目的基因的农杆菌菌 液培养至 OD600为 0.6～0.8，6000 rpm 离心1 min,弃上清液后用 1/2 MS悬浮液培养基重悬至 OD600为 0.5，浸染子叶节 8 min～10 min，取出子叶节放置在无菌滤纸上吸干残留浸染液，将子叶节放置于共 培养基上培养 2 d～3 d。 抑菌培养 共培养结束后，用无菌水清洗子叶节，无菌滤纸吸干水分后转至抑菌培养基培养 5 d～7 d。 筛选培养 将抑菌后的子叶节转到筛选培养基中， 20 d后将筛选出的甜菜抗性芽移入分化培养基，进行分化 扩繁。 生根培养 待筛选出的甜菜幼苗长到 3 cm～5 cm时，转入生根培养基培养 20 d～30 d，诱导根的形成。 10 炼苗移栽 组培室内开盖炼苗 2 d～3 d，选择分化出粗壮根系的甜菜幼苗从组培瓶中移出，自来水冲洗根部 并浸泡8 h～12 h，随后移栽到花盆土中，暗室中暗培养 24 h后，放置人工气候室培养 7 d～14 d。待 盆栽幼苗生长至 4片～6片真叶， 且平均气温稳定在 10 ℃以上时， 选择早晚或者气温较低时移入大田， 避免阳光直射。炼苗移栽过程按照 DB15/T 2044 执行。 11 转基因植株检测 利用基因组 PCR或RT-PCR对目标基因进行检测。