ICS 11.220 CCS B 41 1304 邯郸市 地方 标准 DB 1304/T 516—2025 噬菌体及其裂解酶防控禽气源性病原 菌感染技术规程 2025 - 06 - 27发布 2025 - 07 - 20实施 邯郸市市场监督管理局 发布 DB 1304/T 516 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由河北工程大学提出。 本文件起草单位：河北工程大学。 本文件主要起草人： 钟翠红、王方方、崔国林、左海龙、王艳梅、张占丽、霍志闯、和彦泽、张永 英、张延明、李培、刘嘉楠、石玉祥、左海堂、韩晓飞、 康金哲、冯莎莎。 DB 1304/T 516 —2025 1 噬菌体及其裂解酶防控禽气源性病原菌感染技术规程 1 范围 本文件规定了 噬菌体及其裂解酶防控禽气源性病原菌感染技术 的术语和定义、空舍消毒、引种补栏、 饲养管理。 本文件适用于 规模化养禽场气源性病原菌感染的防控。 猪、羊、兔等其它舍饲动物养殖场也可 参照 执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 13078 饲料卫生标准 GB/T 25886 养鸡场带鸡消毒技术要求 NY 5027 无公告食品 畜禽饮用水质 NY/T 388 畜禽场环境质量标准 NY∕T 472 绿色食品 兽药使用准则 DB13/T 6114 —2025 养鸡场饮水线杀菌技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 禽气源性病原菌感染 存在于禽舍空气的病原菌，通过空气、饲料等媒介感染禽类呼吸道、消化道等组织器官，进而引起 机体发生疾病。 3.2 禽舍通风系统 为保证禽舍空气温度、湿度、空气卫生和气流速度等参数达到畜禽场环境质量标准的要求，对禽舍 空气进行集中处理、输送的所有设备、管道及附属设施的总称。 4 空舍消毒 用1:600过硫酸氢钾等消毒剂或火焰喷枪焚烧等方法对禽舍地面和墙面消毒处理，将清洗干净的饲 养禽类所需物品移到舍内， 然后再按空气熏蒸剂说明对禽舍环境进行熏蒸消毒， 消毒过程中， 封闭鸡舍， 舍内温度保持在 20 ℃以上，相对湿度达到 60 %～80 %。 5 引种补栏 从具备种畜禽生产经营资格的场区引进禽类，引进的禽类应有产地动物检疫合格证明。对即将进场 （舍）的禽类需进行检疫， 参照家禽产地检疫规程农医发 [2010]20 号执行。 DB 1304/T 516 —2025 2 6 饲养管理 6.1禽舍空气质量监测 根据养禽场空气污染和禽发病状况， 确定禽舍 空气环境质量监测频度。 参照 NY/T 388检测方法要求， 采集禽舍内空气样品并进行检测，禽舍空气细菌浓度、总悬浮微粒 (TSP)、PM10、硫化氢、氨气等空气 环境质量指标符合 NY/T 388 要求；否则，调控禽舍通风系统加强禽舍通风，同时增加消毒次数。 6.2 禽舍环境消毒 参照GB/T 25886 进行带禽消毒，利用禽舍喷雾消毒线或消毒设备向禽舍喷洒 1×106 PFU/ml噬菌体 噬菌体及其 0.2 mg/ml的裂解酶悬液，每周喷洒噬菌体及其裂解酶悬液、消毒液各 1次。利用消毒设备向 禽舍粪便传送带、地面喷洒噬菌体及其裂解酶悬液，每周喷洒 1-2次；及时更换通风口的空气净化过滤 滤膜。禽发病期间，增加禽舍环境消毒次数。 6.3饮水质量 按照DB13/T 6114 -2025进行禽舍饮水线消毒，每周 1次。保证饮生质量达到 NY 5027 畜禽饮用水质 标准要求。 6.4饲料质量 保证饲料质量达到 GB 13078 饲料卫生标准要求。 6.5人员和物品管理 禁止无关人员进入禽舍，工作人员应经消毒后才能进入禽舍，禁止串舍。进入禽舍的所有物品都 应 消毒处理，各栋舍之间禁止串用饲养工具、器具。 6.7无害化处理 参照GB 16548规定对病死及病害动物进行无害化处理；及时清理禽舍内粪便，粪便及其污物处理按 NY/T 1168 规定执行。 6.8禽气源性细菌疾病的防治 6.9禽气源性细菌疾病的预防 向禽饲料中添加 0.1 %浓度为3×1010 PFU/g噬菌体微囊和 0.5 ‰裂解酶脂质体，每月 2次。禽类疾病 发生流行期间，增加消毒次数和饲喂噬菌体微囊和裂解酶脂质体次数。也可参照 NY∕T 472要求，进行 预防性投喂兽药。 6.10禽气源性细菌疾病的治疗 参照NY∕T 472要求，结合药敏试验投喂兽药。 向饲料中添加 3×1010 PFU/g噬菌体微囊和 0.5 ‰裂解 酶脂质体。 DB 1304/T 516 —2025 3 A A 附录 A （规范性） 噬菌体混悬液的制备方法 A.1 采样 按照GB/T 5750 从养鸡场饮水管道采集水样。 A.2 分离鉴定 A.2.1 细菌分离鉴定 按照GB 4789.3 、GB 4789.4 、GB 4789.5 分离鉴定沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏菌；按传统细菌分 离纯化方法和 16 srRNA鉴定铜绿 假单胞菌、空肠弯曲菌。 A.2.2 噬菌体分离鉴定纯化 A.2.2.1 分离 将鉴定的病原菌作为诱导菌，利用双层琼脂平板法培养噬菌体，挑选大小一致噬菌斑。 A.2.2.2 形态鉴定 吸取噬菌体培养液，加至电镜专用铜网上，用 2 %醋酸铀染色，干燥，通过透射电子显微镜观察噬 菌体超微结构。 A.2.2.3 纯化 利用双层琼脂平板法对具有典型形态特征的噬菌体进行纯化。 A.3 混悬液制备 将上述纯化后的大肠杆菌、 沙门氏菌、 铜绿假单胞菌、 空肠弯曲菌和志贺氏菌噬菌体按照 1:1:1:1:1 的比例，制备成噬菌体混悬液，效价应不低于 109 PFU/ml。 DB 1304/T 516 —2025 4 B B 附录 B （规范性） 噬菌体裂解酶混悬液的制备方法 B.1 噬菌体裂解酶基因鉴定 B.1.1 噬菌体全基因组测序 提取噬菌体基因组并测序，对测序原始数据进行质控与组装，采用注释工具（如 RAST、Prokka、 PHANOTATE ）预测开放阅读框（ ORFs）。 B.1.2 噬菌体裂解酶基因鉴定 通过NCBI BLAST 进行同源性比对，利用保守结构域数据库（ NCBI CDD、Pfam、InterPro ）确认裂解 酶功能域。 B.2 噬菌体裂解酶表达系统构建 B.2.1 噬菌体裂解酶表达质粒构建 根据噬菌体裂解酶碱基序列设计引物， PCR扩增裂解酶基因，采用限制性内切酶对裂解酶基因及表 达载体进行双酶切，使用 T4 DNA连接酶构建重组裂解酶表达质粒。 B.2.2 噬菌体裂解酶大肠杆菌表达系统构建 采用热激法将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株， 涂布于含相应抗性的培养基， 筛选阳性表达菌株。 B.3 噬菌体裂解酶诱导表达 将阳性菌株接种至含相应抗性的 LB培养基， 37 ℃振荡培养至菌液 OD600值达0.6，加入终浓度为 0.8 mM的IPTG诱导剂， 28 ℃诱导培养 10 h。 B.4 噬菌体裂解酶纯化 B.4.1 表达菌株超声破碎 收集诱导后菌液， 5000 r/min离心5 min，菌体沉淀用非变性裂解液洗涤 3次，菌体沉淀用非变性裂 解液重悬，采用超声破碎仪破碎菌体，释放裂解酶。 B.4.2 噬菌体裂解酶纯化 超声后菌液于 10000 r/min离心5 min，收集上清液，采用镍柱亲和层析法纯化上清液中的噬菌体裂 解酶。 B.5 噬菌体裂解酶悬液制备 采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定纯化裂解酶浓 度，用无菌 PBS将裂解酶稀释至 1.0 mg/mL，制成噬 菌体裂解酶悬液。