ICS 65.020.01 CCS B 05 13 河北省 地方 标准 DB 13/T 6103—2025 羊肚菌菌种出菇特性评价技术规程 2025 - 05 - 27发布 2025 - 06 - 03实施 河北省市场监督管理局 发布 DB 13/T 6103 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件主要起草单位： 河北农业大学、 河北汇珍食用菌有限公司、 唐山市农业环境保护监测站、 河北省农业特色产业技术指导总站 本文件主要起草人 : 李守勉、田景花、庞立新、亢锐锋、李国杰、李肖、王俊玲、李晓峰、赵 清、张艳明、王民乐、贾智麟、张世青、李梅。 本文件为首次发布。 DB 13/T 6103 —2025 1 羊肚菌菌种出菇特性评价技术规程 1 范围 本文件规定了羊肚菌菌种出菇特性评价 的术语和定义、 抽样、 出菇特性评价、 综合评价等要求。 本文件适用于羊肚菌菌种出菇特性的评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 12728 食用菌术语 GB/T 30989 高通量基因测序技术规程 NY/T 1284 食用菌菌种中杂菌及害虫的检验 NY/T 1846 食用菌菌种检验规程 DB13/T 5170 日光温室羊肚菌栽培技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 萌发时间 germination time 适宜环境条件下，接种块在培养基上恢复生长的时间。 定植率 colonization rate 接种块转接到培养基上后，萌发的接种块数量占总接种块数量的百分比。 4 抽样 菌种抽样应符合 NY/T 1846 的规定。 5 菌种出菇特性评价方法 感官评价 应符合 NY/T 1846 的规定，感官评价指标参见附录 C。 杂菌及害虫评价 应符合 NY/T 1284 的规定。 菌种真实性 评价 5.3.1 基因组DNA提取 采用CTAB法提取菌种菌丝体基因组 DNA， DNA 浓度应≥ 50 ng/μL，A260/A280 应为1.8～2.0。 提取方法参见附录 A。 5.3.2 PCR 扩增 采用真菌通用引物 ITS1/ITS4 进行PCR扩增，PCR 扩增体系和扩增程序参见附录 B。 DB 13/T 6103 —2025 2 5.3.3 电泳检测 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 采用凝胶成像系统拍照并记录电泳条带，黑色羊肚菌类群 （包括六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌等）条带大小应为 800 bp，且无其他杂带，将样品进 行双向测序，测序方法应符合 GB/T 30989 的规定。 5.3.4 数据库比对 将测序结果 在NCBI数据库中进行Blastn比对（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ），分析测序 菌株的分类地位。 5.3.5 系统发育树的构建 下载已报道的羊肚菌 ITS 序列，用Bioedit、Sequence Matrix软件将序列对比拼接 ，利用RAxML 软件进行 最大似然法 (maximum likelihood, ML) 构建羊肚菌属系统发育树 ，明确测序菌株的分类地 位。羊肚菌生产用菌株分类地位应为 六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌等。 交配型基因检测 采用CTAB法提取羊肚菌菌种菌丝体 基因组DNA，每个样品应设置三个重复，采用黑色羊肚菌 类群 交配型基因特异性引物 MAT1-1、MAT1-2进行PCR扩增，引物序列、 PCR 扩增体系和扩增程序参见附录 B。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶成像系统拍照并记录电泳条带， MAT1-1和MAT1-2 分别对应的条带大小分别为 800 bp和500 bp，生产用菌种应 同时含有 MAT1-1和MAT1-2两种交配型基 因。 菌种活力评价 5.5.1 平板继代培养 在培养皿 PDA 培养基中央接种抽检菌种，接种块 约为（直径） 6 mm ×（厚）1 mm～2 mm，置于 18 ℃避光培养 2 d～3 d，当菌丝生长至距离培养皿边缘约 0.5 cm 时，用打孔器取菌落尖端直径 约6 mm的菌丝圆片，每个样品 5个重复，转接至新的 PDA 平板培养基中央继代培养。 5.5.2 菌种萌发评价 菌种块应在继代培养 6 h～10 h内萌发。 5.5.3 定植率测定 每个测试菌种数量为 m，接种3 d 菌丝萌发且定植的数量为 n，定植率 X 计算公式如下： X= mn×100%…………………………………… …（1） 式中： X——定植率， % n——定植的总瓶（袋）数量 m——接种的总瓶（袋）数量，一般接种 30瓶（袋） 5.5.4 菌丝生长速率 在继代培养 1 d、2 d、3 d 时，采用十字交叉法分别测量菌落直径，菌丝生长距离为 S，生长天 数为D，菌丝平均生长速率 L计算公式如下： L= DS………………………………………………… （2） 式中： L——母种菌丝生长速率， mm/d S——菌丝生长距离， mm DB 13/T 6103 —2025 3 D——长天数为 D，d 5.5.5 菌丝生长势评价 在继代培养 5 d～6 d 时，观察菌落边缘整齐度，菌丝浓密程度，尖端菌丝分支情况。 5.5.6 菌丝形态镜检 继代培养 2 d～3 d 后，采用 400倍光学显微镜观察菌丝分支角度，主干菌丝与二级分支菌丝夹 角；采用DAPI（pH=7.5）染色，在 100倍荧光显微镜下观察尖端 菌丝单个细胞内的细胞核数量。菌丝 镜检应符合 NY/T 1846 的规定。 5.5.7 菌核 在PDA培养基上继代培养 7 d～10 d ， 观察菌核发生情况， 菌落表面应产生白色颗粒或片状菌核。 5.5.8 菌落颜色 继代培养 10 d～15 d，观察菌落颜色。 出菇评价 5.6.1 场地要求 选择温度、湿度、光照、通风等条件可控的出菇房、智能出菇箱或人工气候培养箱等。 5.6.2 栽培方法 采用塑料筐、塑料袋或床架覆土方式进行出菇试验，每个样品随机设置 3个重复，每个小区栽培 面积应不少于 3 m2。栽培管理参照 DB13/T 5170 执行。 5.6.3 菌种萌发 及分生孢子形成 播种 24 h观察菌种萌发情况，播种 5 d～10 d观察分生孢子形成情况。 5.6.4 外源营养袋 摆放外源营养袋 20 d～25 d，观察营养袋内菌丝生长情况。 5.6.5 羊肚菌原基形成 浇催菇水后 7 d～10 d，采用手机摄像头放大 5～10倍观察原基形成情况。 6 综合性评价 羊肚菌菌种出菇特性评价按照杂菌及害虫、菌种真实性、交配型基因、出菇性能等评价要求进 行，其中任何一项不符合要求时，均为不合格菌种；菌种气味、菌种萌发、菌落颜色、菌丝生长速 率、菌丝形态镜检等指标有 2～3项不符合要求时，再申请复检一次，以复检结果作为最终判定依据 应进行复检。全部指标符合要求的为合格菌种。